張尚前，周先泰，覃秋宜，齊娜

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004)

槲皮素(Quercetin，QT)，是一種五羥黃酮，大部分以苷的形式存在于植物的花、葉或果實中，具有化痰、止咳、平喘的功效，用于治療慢性支氣管炎，還具有降低血壓的療效，可用于輔助治療冠心病及高血壓[1]。目前，有研究表明其還可用于治療肝癌[2-3]。槲皮素可溶于甲醇、吡啶、丙酮等有機溶劑，易溶于乙醇，但不溶于水，所以藥物溶出和吸收比較受限，導(dǎo)致其生物利用度較低[4]。

微球是指藥物溶解或分散在載體材料中形成的微小球狀實體。微球粒徑范圍一般為1～500 μm，根據(jù)制備微球的載體材料不同，主要分為天然高分子微球，如淀粉微球、白蛋白微球、明膠微球、殼聚糖等，和合成聚合物微球，如聚乳酸微球等[5-6]。其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]微球可使藥物在體內(nèi)幾周或幾個月內(nèi)以一定速率緩慢釋放，實現(xiàn)緩釋的目的。與現(xiàn)有常規(guī)制劑比較，微球減少了給藥次數(shù)，且提高了患者的順應(yīng)性[7]。

槲皮素水溶解性差，將其制備成緩釋微球制劑可以提高溶解性，改善其吸收和分布，提高其生物利用度，為槲皮素的開發(fā)與利用提供了新選擇。Shirasu porous glass(SPG)膜乳化技術(shù)在控制微球粒徑分布方面具有獨特優(yōu)勢，SPG膜是由親水性玻璃材料Al2O3-SiO2制成的一種多孔玻璃膜，通過SPG膜制備的脂溶性載體PLGA微球，粒徑均一可控，是制備微球最常用的方法之一[6-8]。PLGA為生物可降解材料，降解產(chǎn)物無毒，具有生物相容性好、生物降解可控、緩控釋等優(yōu)點。本實驗采用SPG膜乳化的方法，以PLGA為藥物的載體材料來制備槲皮素緩釋微球。實驗通過改變過膜壓力、連續(xù)相攪拌速度、油水相體積比、聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol)，PVA]濃度來優(yōu)化微球形態(tài)、粒徑及其分布，考察不同的槲皮素用量和PLGA用量來優(yōu)化包封率和載藥量，以此得到槲皮素微球最優(yōu)處方。利用直接釋藥法和超速離心法[9-10]結(jié)合對槲皮素微球的體外釋放行為進行考察。以期得到表征良好的槲皮素長效緩釋微球。

1 儀器與試藥

1.1儀器 MG-20型SPG膜乳化機，SPG膜(孔徑1.1 μm)(嘉盛(香港)科技有限公司)，TGL-16臺式高速離心機(金壇區(qū)金城春蘭實驗儀器廠)，CP225D電子天平(德國Sartorius公司)，ZD-85恒溫振蕩儀(北京國華科技集團有限公司)，UV-1800PC紫外可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司)，Olympus CX22光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，ZS90型激光粒度分析儀(英國Malvern公司)。

1.2藥品與試劑 槲皮素(西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號：XC081218，含量≥ 98%)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，LA/GA=50/50，Mr 200 000，廣州創(chuàng)賽生物醫(yī)用材料有限公司)，二氯甲烷(廣東光華科技股份有限公司)，聚乙烯醇(PVA-1799，上海信裕生物科技有限公司)，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1槲皮素含量測定方法建立 紫外-可見分光光度法190～600 nm范圍內(nèi)全波長掃描，配制2，5，8，10，12和15 μg·mL-1的槲皮素標準溶液，測定吸光度(A)，以濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標，A為縱坐標，繪制標準曲線[1]。取適量對照品溶液高、中、低濃度組，各溶度組分別連續(xù)測定3次，計算組內(nèi)相對標準偏差(RSD)評價精密度，0，2，4，8，12 h測定各組間RSD評價不同時間的穩(wěn)定性[5]，反復(fù)取高、中、低濃度組連續(xù)測定6次吸光度，計算RSD評價含量測定方法的重復(fù)性。

紫外-可見分光光度法測定槲皮素最大吸收波長在375 nm，選擇375 nm波長處進行吸光度測定，槲皮素2～15 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線方程A=0.049 8C+0.001 4，r=0.999 2。不同溶度組RSD分別為1.98%，0.90%，1.09%精密度良好，表明不同濃度之間該測定方法干擾性小。12 h內(nèi)3組間RSD為1.75%，1.53%，1.76%，表明12 h內(nèi)該測定方法干擾性小。重復(fù)性考察RSD為1.46%，1.76%，1.77%，表明該測定方法重復(fù)性良好，由此可知該方法符合方法學(xué)要求[6]。

2.2槲皮素微球的制備 精密稱取適量槲皮素用無水乙醇溶解，稱取適量PLGA，二氯甲烷溶解，將兩溶液混合均勻制得分散相液體，倒入分散相罐中。稱取適量PVA，配置成不同濃度的PVA溶液，即得連續(xù)相。安裝膜乳化裝置，氮氣將分散相擠出使其通過SPG膜進入到分散相，進行乳化反應(yīng)。連續(xù)相中產(chǎn)生大量的氣泡時關(guān)掉氮氣。然后乳液攪拌4～6 h，最終得槲皮素微球混懸液[11-12]。取少量微球混懸液，顯微鏡觀察；粒徑分析儀測粒徑及其分布。離心(8 000 r·min-1)，除去上清液，去離子水洗滌3次，冷凍干燥，即得槲皮素微球。

2.3槲皮素微球載藥量與包封率的測定 精密稱量槲皮素緩釋微球10 mg，二氯甲烷溶解，無水乙醇定容至刻度，離心(10 000 r·min-1)10 min后，在375 nm波長下測定上清液的吸光度，代入標準曲線計算藥物濃度與質(zhì)量，按照以下公式計算微球包封率(encapsulation efficiency，EE)和載藥量(drug loading，DL)[13]：

EE(%)為包封率，DL(%)為載藥量，W1，W2和W3分別表示包封于微球中槲皮素的質(zhì)量，槲皮素的總質(zhì)量和槲皮素微球總質(zhì)量

2.4槲皮素緩釋微球的處方優(yōu)化 槲皮素緩釋微球的處方優(yōu)化從兩個方面進行，一方面考察過膜壓力，連續(xù)相攪拌速度，油水相體積比，外水相PVA濃度對微球粒徑及其分布的影響；另一方面考察槲皮素用量，PLGA用量對微球包封率和載藥量的影響，從而得到制備槲皮素緩釋微球的最優(yōu)處方。

2.4.1過膜壓力對載藥微球粒徑及其分布的影響 按“2.2”項下的方法制備微球，實驗采用厚度1.1 μm SPG膜，設(shè)置過膜壓力分別為0.012，0.017，0.026，0.031 MPa。制得微球并在光學(xué)顯微鏡下觀察[4]，在粒徑分析儀中測定平均粒徑和多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)。

由圖1可知，隨著過膜壓力增大，其粒徑逐漸減小，當過膜壓力最小時，其PDI最大。當壓力為0.017 MPa時，其粒徑較小，PDI為0.728，數(shù)值最小，此時槲皮素微球的分布較其他壓力下相對均勻。當過膜壓力大于0.017 MPa，并壓力逐漸增大時，其PDI并沒有很明顯的變化。因此本實驗選擇過膜壓力為0.017 MPa進行后續(xù)的實驗。

圖1 過膜壓力對載藥微球粒徑及其分布的影響

2.4.2連續(xù)相攪拌速度對載藥微球粒徑及其分布的影響 按“2.2”項下的方法制備微球，設(shè)置連續(xù)相攪拌的速度為300，400，500，600 r·min-1制備微球，并在光學(xué)顯微鏡下觀察微球形態(tài)，在粒徑分析儀中測定平均粒徑和PDI。

由圖2可知，隨著連續(xù)相攪拌速度的提高，粒徑逐漸減小，到達600 r·min-1時，粒徑變化不大，但攪拌速度的變化對微球的PDI影響不大。當連續(xù)相的攪拌速度為500 r·min-1時，其PDI最小，此時顯微鏡表觀槲皮素微球分布也相對較為均勻，因此選用500 r·min-1轉(zhuǎn)速作為后續(xù)實驗的條件。

圖2 連續(xù)相攪拌速度對載藥微球粒徑及其分布的影響

2.4.3油水相體積比對載藥微球粒徑及其分布的影響 按“2.2”項下的方法制備微球，設(shè)置油水相的體積比為1：6，1：7，1：8，1：9制備微球[6]，并在光學(xué)顯微鏡下觀察微球，在粒徑分析儀中測定平均粒徑和PDI。

由圖3可知，油水相體積比為1：8時，其PDI最小，為0.476，槲皮素微球分布相對較為均勻，且此時平均粒徑與SPG膜孔徑大小也較為接近。所以本實驗選擇油水相體積比1：8進行后續(xù)實驗。

圖3 油水相體積比對載藥微球粒徑及其分布的影響

2.4.4外水相PVA濃度對載藥微球粒徑及其分布的影響 按“2.2”項下的方法制備微球，設(shè)置PVA濃度分別為0.25%，0.5%，1%，2%制備微球，并在光學(xué)顯微鏡下觀察微球，在粒徑分析儀中測定平均粒徑和PDI。

由圖4，5可知，平均粒徑的大小隨著PVA濃度的增大而增大。當PVA濃度為0.5%時，其PDI最小，其平均粒徑也較小，為0.623 μm。本實驗選擇PVA濃度0.5%進行后續(xù)實驗。

圖4 PVA濃度對載藥微球粒徑及其分布的影響

經(jīng)粒徑分析儀的測定結(jié)合單因素考察，制備微球粒徑及其分布較好的處方條件是：過膜壓強為0.017 MPa，攪拌速度定為500 r·min-1，油水相體積比為1：8，外水相PVA濃度為0.5%。

2.4.5槲皮素用量對載藥微球包封率和載藥量的影響 按“2.2”項下的方法制備微球，考察槲皮素用量為5，10，15 mg對微球包封率和載藥量的影響[14]。

由圖6可知，不同的槲皮素用量對載藥微球的載藥量和包封率都有一定的影響。當槲皮素用量增加時，載藥微球的載藥量隨之增大，但其包封率卻逐漸減小，所以當槲皮素用量為5 mg時，其包封率最大，為91.61%。均衡分析，選擇了槲皮素用量為5 mg來進行后續(xù)實驗。

圖5 槲皮素微球的光學(xué)顯微圖(×100)

圖6 槲皮素用量對載藥微球包封率和載藥量的影響

2.4.6PLGA用量對載藥微球包封率和載藥量的影響 按“2.2”項下的方法制備微球，考察PLGA 50，100，150 mg的用量對微球包封率和載藥量的影響[15]。

由圖7可知，當PLGA用量增加時，其載藥量隨之減小，PLGA用量為50 mg和用量為100 mg的載藥量近似，而包封率在PLGA用量為100 mg時最大，為91.61%。所以綜合考慮包封率和載藥量，選擇PLGA的用量為100 mg來進行后續(xù)實驗。

圖7 PLGA用量對載藥微球包封率和載藥量的影響

綜上考察，最優(yōu)處方為：過膜壓力0.017 MPa，攪拌速度500 r·min-1，油水相體積比1：8，外水相PVA濃度0.5%，槲皮素為5 mg，PLGA為100 mg。

2.4.7驗證實驗 使用最優(yōu)處方制備槲皮素微球，使用激光粒度儀對其粒徑及其分布進行考察，通過光學(xué)顯微鏡對形態(tài)進行驗證。

制得的槲皮素微球干燥后呈黃色粉末狀，粒徑為(0.623±0.05)μm，PDI為(0.467±0.10)，見圖8，粒徑較小且分布較均勻，經(jīng)顯微鏡觀察該微球形態(tài)圓整，如圖9，包封率較高，為(91.61±4.15)%，載藥量為(6.97±0.45)%。結(jié)果見表1。

表1 最佳處方驗證

圖8 處方優(yōu)化后槲皮素微球的粒徑分布

圖9 處方優(yōu)化后槲皮素微球的光學(xué)顯微圖(×100)

2.5槲皮素緩釋微球的體外釋放 本實驗是利用直接釋藥法和超速離心法結(jié)合來測定槲皮素緩釋微球的體外釋放行為[12，16-18]。取凍干的載藥微球10 mg，置于離心管中，加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solu tion，PBS)(pH值=7.4)4 mL，將離心管置于恒溫振蕩器中(37 ℃，100 r·min-1)振蕩，分別于0.5～576 h取出上清液4 mL并在10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心5 min，采用紫外分光光度法測定吸光度，并再加入PBS緩沖液4 mL，繼續(xù)振蕩。測得吸光度計算累積釋放率，繪制槲皮素微球的體外釋藥曲線。公式如下：

式中Cn為各時間點取樣時測的槲皮素濃度，V為加入的釋放介質(zhì)的體積，W稱取的微球質(zhì)量，D為微球的載藥量。

選擇最優(yōu)處方制備槲皮素微球3組平行樣品，參考藥典[13]微粒制劑指導(dǎo)原則，體外釋放實驗中關(guān)于突釋效應(yīng)，要求開始0.5 h內(nèi)的釋放量要求低于40%，本試驗中0.5 h時累積釋放率為2.45%，沒有出現(xiàn)突釋效應(yīng)。12 h時累積釋放率達到16.41%，576 h時累積釋放率為80.84%，見圖10，槲皮素微球的釋放率曲線明顯平緩，說明該微球釋放平穩(wěn)，有明顯的緩釋特征。

圖10 槲皮素微球體外釋放曲線

3 討論

當過膜壓力較小時，則無法克服分散相與連續(xù)相之間的界面張力的作用，分散相就無法迅速從膜上脫離下來，于是在膜表面形成的乳液滴變大，當分散相流速不變，剪切力剪切下來的液滴粒徑就會相對較大，導(dǎo)致粒徑分布不均勻，壓力為0.012 MPa時，平均粒徑及其PDI都較大。壓力較大時，分散相從膜上脫離的速度變快，但流速不變，剪切力也不變，使剪切的液滴粒徑相對較小[19]。

在膜乳化過程中，液滴的形成是由于流動相攪拌速度產(chǎn)生流速剪切力的結(jié)果，流速剪切力作用于膜表面的分散相液滴，使其從膜上剪切脫離下來。攪拌速度越小，流速剪切力越小，剪切液滴的速度變慢，液滴粒徑變大，反之，粒徑變小[20-21]。當流動相攪拌速度為300 r·min-1時，攪拌速度最小，其平均粒徑最大，隨著壓力增大，其平均粒徑變小。

連續(xù)相的體積越小時，分散相和連續(xù)相的體積比變小，此時液滴之間空間變小，容易發(fā)生碰撞，較易融合，所以會導(dǎo)致液滴粒徑變大，影響粒徑分布。當分散相與連續(xù)相的比值為1：6時，其粒徑最大，PDI也最大。當連續(xù)相體積增大時，液滴之間碰撞概率變小，從而液滴融合的幾率減少，所以微球粒徑的均一性較好[22]。

改變外水相PVA濃度的情況下，外水相溶質(zhì)的濃度越大，乳滴的粒徑越大，同理，當濃度變小時粒徑變小。當濃度變大時，其平均粒徑也逐漸增大，其原因是連續(xù)相的溶質(zhì)濃度增大其粘度增大，連續(xù)相的流速變慢，其流速剪切力變小，會導(dǎo)致乳滴從膜表面上脫離的速度變慢，形成液滴的分散相增多[23]，微球的粒徑變大。

槲皮素用量增加時，一方面，在乳化過程中，油相中的槲皮素濃度增加，初乳液中油相的粘度增加，其穩(wěn)定性會變好，從而減少了油水相融的現(xiàn)象，提高了藥物的包封率[24]。而本實驗中的槲皮素用量增加而包封率卻逐漸減小，則可能是由于選取投入的藥量已超過PLGA的載藥范圍[19]。同時，槲皮素用量增加，水相包裹和吸附的量也增加，所以微球的載藥量增加，另一方面，在做破乳實驗時槲皮素微球里的槲皮素濃度大，內(nèi)外水相的濃度差較大，槲皮素擴散到外水相的量增多，測得槲皮素濃度較大，從而載藥量隨投藥量的增加而增大[13]。

乳化過程中，PLGA用量影響著油相的濃度與粘度，當PLGA用量加大，則油相的濃度和粘度變大，二氯甲烷會加快揮發(fā)速度，從而加快微球的固化，也就提高了藥物的包封率[25]。而當PLGA量增加的同時，槲皮素的量不變，導(dǎo)致一部分PLGA過剩，從而使載藥量減小。

藥物在PLGA微球中的釋放有兩種機制[26-27]：一種是吸附或者嵌入在微球表面的藥物快速擴散到釋放介質(zhì)中去；另一種是在微球表面的藥物快速釋放之后，包入微球中的藥物依靠PLGA載體在釋放介質(zhì)中緩慢釋放。通常情況下，藥物的擴散貫穿整個釋藥過程。由于槲皮素難溶于水，參考文獻[1]和藥典[18]緩釋、控釋和遲釋制劑指導(dǎo)原則加入2%的SDS，在釋放初期吸附和嵌入在微球表面的槲皮素快速釋放，微球會吸水稍微膨脹，包入微球中的槲皮素也會通過微球表面細小的孔道釋放出來，開始釋放的藥物濃度較大，而當溶脹達到平衡[28]時，槲皮素的釋放以PLGA降解的方式擴散，因此后面的釋藥速率相對較慢，累積釋放率曲線相對平緩[29-30]。