楊敏華，姚友杰，王娟，陳亞奇，劉高仁，王森

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/河南省中醫(yī)院急診內(nèi)科，鄭州 450002；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450052；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)學(xué)院，鄭州 450008)

膿毒癥(spesis)是重癥監(jiān)護(hù)病房死亡發(fā)生的主要原因之一，主要表現(xiàn)為炎癥遞質(zhì)大量釋放、彌漫性血管內(nèi)凝血及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[1]。其中，心臟和肺臟是膿毒癥侵犯的常見(jiàn)靶器官，也是造成膿毒癥患者死亡的主要原因[2]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，伴隨著大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，致使促炎-抗炎動(dòng)態(tài)平衡被打破。目前，對(duì)膿毒癥的治療主要以控制炎癥反應(yīng)、減輕臟器損傷為主。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AG)是從植物穿心蓮葉片中提取得到的一種二萜內(nèi)酯，具有抗病毒、抗炎抗菌、保肝、抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)免疫等[3-7]，在治療關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)炎、椎間盤(pán)退變等炎癥性疾病中已得到廣泛應(yīng)用[8-11]。已有研究表明AG可用于治療膿毒癥[12-14]，但AG對(duì)膿毒癥的具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本文用脂多糖誘導(dǎo)建立膿毒癥模型大鼠，探討AG對(duì)模型大鼠的心、肺組織損傷和炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)、雄性、8～10周齡、SD大鼠60只，體質(zhì)量(260.7±21.5)g，購(gòu)自北京維通利華公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0001，動(dòng)物使用的倫理審批號(hào)：LLPZ-012。飼養(yǎng)溫度26～28 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由采食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)的3R原則。

1.2試劑與儀器 AG粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，含量≥98%，批號(hào)：365645；利奈唑胺購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量≥99%，批號(hào)：130640-201901，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC，購(gòu)自美國(guó)Biovision公司，批號(hào)：1676-100)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號(hào)：D006-1-1)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RB公司；TRIzol試劑盒(批號(hào)：15596026)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；BCA蛋白定量試劑盒(P0012S)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)化學(xué)發(fā)光液(批號(hào)：WP20005)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；Gel View 6000凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自廣州云星儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN公司。

1.3方法

1.3.1建模和分組給藥 ①將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，AG小劑量、中劑量、大劑量組(LPS+AG 2.5 mg、LPS+AG 5 mg和LPS+AG 10 mg)組，利奈唑胺(linezolid，LNZ)組(LNZ 25 mg)。除正常對(duì)照組外，各組大鼠均腹腔注射LPS(10 mg·kg-1)復(fù)制膿毒癥大鼠模型[15]，造模后通過(guò)觀察大鼠呼吸頻率、皮溫、心率、口鼻分泌物、精神狀態(tài)等判斷造模成功與否。AG小劑量、中劑量、大劑量組于造模后立即、8 h和16 h給予AG 2.5，5，10 mg·kg-1，利奈唑胺組給予利奈唑胺25 mg·kg-1，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液。②另取大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、AG大劑量組(AG 10 mg)、PDTC+模型組(PDTC 50 mg)和PDTC+AG大劑量組。造模方法、給藥方法、取材時(shí)間同上。造模24 h后處死大鼠，采樣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2肺濕/干重比值(W/D)測(cè)定 取各組大鼠肺臟，用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗凈，吸去多余水分，稱定質(zhì)量，記為濕重(W)。用溫箱在80 ℃條件下干燥48 h后，再次稱定質(zhì)量，記為干重(D)。W/D=(濕重-干重)/干重。

1.3.3HE染色檢測(cè)心肺組織病理?yè)p傷 取各組心臟、肺臟用PBS充分洗凈，10%中性甲醛固定，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋過(guò)程，制成切片厚度4 μm。經(jīng)過(guò)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察心臟、肺臟病理學(xué)改變。

1.3.4ELISA檢測(cè)大鼠心肌損傷標(biāo)記物和炎癥細(xì)胞因子含量 取各組心肌組織適量，制成1：9勻漿液，4 ℃條件下3000 r·min-1×10 min(離心半徑r=13.5 cm)，收集上清液，嚴(yán)格按照試劑盒操作，測(cè)定心肌損傷標(biāo)記物肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和肌紅蛋白(myoglobin，Mb)含量。取各組大鼠眼眶靜脈血，4 ℃條件下3000 r·min-1×10 min(離心半徑r=13.5 cm)，收集上清液，嚴(yán)格按照試劑盒操作，測(cè)定炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)的含量。

1.3.5Western blotting檢測(cè)心肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平 用RIPA蛋白裂解液提取各組心臟和肺臟總蛋白，用BCA法測(cè)定并調(diào)平蛋白濃度。每組取等量蛋白質(zhì)用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，加入一抗(1：500)，4 ℃孵育過(guò)夜。第2天棄去一抗，洗膜后，加入對(duì)應(yīng)二抗(1：10 000)，室溫封閉1 h后，滴加發(fā)光液曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1AG對(duì)膿毒癥大鼠心、肺組織病理?yè)p傷的影響 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果如圖1所示。正常對(duì)照組大鼠心肌組織未見(jiàn)明顯病理變化，模型對(duì)照組大鼠可見(jiàn)心肌纖維排列紊亂、細(xì)胞核腫脹、部分心肌纖維斷裂、炎性細(xì)胞增多等病理改變，AG中劑量、大劑量組和利奈唑胺組大鼠心肌組織中上述病理改變均有不同程度的改善。

大鼠肺臟組織HE染色結(jié)果如圖1所示：正常對(duì)照組大鼠肺組織未見(jiàn)明顯病理變化，模型對(duì)照組大鼠可見(jiàn)肺泡塌陷，肺泡壁厚度增加，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變；AG中劑量、大劑量組和利奈唑胺組大鼠肺組織病理學(xué)改變均得到改善。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.AG小劑量組；D.AG中劑量組；E.AG大劑量組；F.利奈唑胺組。

2.2AG對(duì)膿毒癥大鼠心肌損傷標(biāo)記物和肺臟W/D影響 ELISA檢測(cè)各組心肌組織勻漿中心肌損傷標(biāo)記物含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠心肌組織勻漿中CK-MB、cTnI和Mb含量顯著增加(t=1.631，1.165，1.438，P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，AG治療組上述指標(biāo)均有不同程度的降低，其中AG中劑量、大劑量組降低程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.83，33.18，104.6，P<0.05或P<0.01)。

測(cè)定各組大鼠肺臟干燥前后兩次質(zhì)量，檢測(cè)AG對(duì)膿毒癥大鼠肺臟W/D的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺臟W/D顯著增加(t=4.744，P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，AG治療組大鼠肺臟W/D均下降，其中AG中、大劑量組比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.11，P<0.05或P<0.01)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.AG小劑量組；D.AG中劑量組；E.AG大劑量組；F.利奈唑胺組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05，③與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

2.3AG對(duì)膿毒癥大鼠炎癥因子表達(dá)的影響 ELISA檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2血清表達(dá)水平顯著上調(diào)(t=1.513，1.936，1.399，1.527，P<0.01)；與模型組比較，AG治療組中上述指標(biāo)表達(dá)水平均明顯下調(diào)，且AG中劑量、大劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=80.93，8.498，38.38，13.99，P<0.05或P<0.01)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.AG小劑量組；D.AG中劑量組；E.AG大劑量組；F.利奈唑胺組①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05，③與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

2.4AG對(duì)膿毒癥大鼠心臟和肺臟組織中HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)和NF-κB p65磷酸化水平的影響 Western boltting檢測(cè)大鼠心肺組織中HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖4所示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠心、肺組織中HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65/NF-κB p65表達(dá)水平顯著上調(diào)(心臟：t=1.086，1.168，1.400；肺臟：t=1.142，1.130，1.138，P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，AG治療組中上述指標(biāo)表達(dá)水平均明顯下調(diào)，且AG中大劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(心臟：F=145.0，84.89，50.86；肺臟：F=52.28，76.15，26.80，P<0.05或P<0.01)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.AG小劑量組；D.AG中劑量組；E.AG大劑量組；F.利奈唑胺組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05，③與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

2.5AG和(或)PDTC對(duì)膿毒癥大鼠心肺損傷、炎癥因子表達(dá)和信號(hào)通路活化的影響 HE染色、心肌損傷標(biāo)記物和肺臟W/D檢測(cè)結(jié)果如圖5-A、B和C所示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠心臟組織可見(jiàn)明顯的排列紊亂、細(xì)胞核消融和炎性浸潤(rùn)等病理改變，且心肌損傷標(biāo)記物含量顯著上升(t=1.526，1.241，1.323，P<0.01)，肺臟組織也可見(jiàn)肺泡塌陷，肺泡壁厚度增加，炎性浸潤(rùn)等病理學(xué)改變，且肺臟W/D也顯著增加(t=4.622，P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，AG和/或PDTC治療組大鼠心肺組織病理學(xué)改變得到明顯改善，心肌損傷標(biāo)記物含量和肺臟W/D也顯著下降(F=223.2，71.22，73.46，70.92，P<0.01)。

ELISA和Western boltting分別檢測(cè)炎癥因子和炎癥信號(hào)通路活化情況，結(jié)果如圖5-D、E和F所示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中炎癥因子和心肺組織中炎癥信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(t=1.404，2.138，1.413，1.511，1.234，1.154，1.504，1.294，1.432，1.390，P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，AG和(或)PDTC治療組大鼠上述指標(biāo)均顯著下調(diào)(F=165.0，15.69，60.34，39.39，37.37，55.11，25.89，79.17，41.54，82.05，P<0.01)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.AG大劑量組；D.PDTC+模型組；E.PDTC+AG大劑量組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

上述結(jié)果均證明，AG改善膿毒癥大鼠心肺損傷和炎癥反應(yīng)的機(jī)制與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65信號(hào)通路活化有關(guān)。

3 討論

目前，關(guān)于AG在膿毒癥的治療研究尚不多，本文通過(guò)腹腔注射脂多糖5 mg·kg-1建立膿毒癥模型大鼠，并分3次于造模后立即、8 h和16 h給予AG治療，造模24 h后，取材進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：模型對(duì)照組動(dòng)物心臟和肺臟組織發(fā)生典型的膿毒癥病理學(xué)改變；同時(shí)，心肌損傷標(biāo)記物含量明顯上升，肺部W/D也增加。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)?zāi)摱景Y模型建立成功。此外，小劑量AG治療后上述檢測(cè)指標(biāo)未見(jiàn)明顯改變，中劑量、大劑量AG則有效改善了心臟和肺臟的病理?yè)p傷程度，降低了心肌損傷標(biāo)記物釋放和肺臟W/D，其中大劑量組效果更優(yōu)，僅次于利奈唑胺。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大劑量AG能有效治療LPS誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠心、肺組織病理?yè)p傷。

研究表明，AG具有較強(qiáng)的抗炎作用，而多種疾病均與炎癥因子大量釋放有關(guān)[11，17]。巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)是白血病趨化因子家族之一，有助于中性粒細(xì)胞聚集到損傷或感染部位，從而調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，是炎癥反應(yīng)的重要部分[18]。研究表明，急性肺損傷發(fā)生時(shí)，肺臟干濕比及肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)水平均發(fā)生改變[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥小鼠模型中，AG能通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡減輕脂多糖誘導(dǎo)的心臟功能紊亂[20]。本研究結(jié)果證明，AG治療能降低膿毒癥大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2)含量。

NF-κB是炎癥反應(yīng)最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，磷酸化激活后可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合并啟動(dòng)促炎基因表達(dá)和炎癥反應(yīng)的擴(kuò)增，從而導(dǎo)致炎癥損傷。因此，抑制NF-κB信號(hào)活化是治療炎癥性疾病的重要手段[21]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)可與內(nèi)源性配體TLR4結(jié)合，使NF-κB磷酸化，激活HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的釋放，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成組織損傷[22]。LIU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，AG治療后，能減少脂多糖誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡和炎癥遞質(zhì)含量，其機(jī)制就與抑制NF-κB途徑密切相關(guān)。另一研究也表明，AG能抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，同時(shí)NF-κB的核易位[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠心臟和肺臟組織中HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白水平均在AG治療后顯著降低。提示膿毒癥大鼠的心肺組織損傷和炎癥反應(yīng)發(fā)生與該通路的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，為了證明此觀點(diǎn)，觀察了NF-κB特異性抑制劑—PDTC[23]和(或)AG治療對(duì)上述檢測(cè)指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PDTC能減輕膿毒癥大鼠心肺組織病理?yè)p傷、心肌損傷標(biāo)記物釋放、肺臟W/D比值、血清炎癥細(xì)胞因子含量和HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)水平，而AG能增加PDTC的上述調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，AG能改善心肺組織病理學(xué)改變，減少心肌損傷標(biāo)記物含量，降低肺臟W/D比值，抑制血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2表達(dá)，抑制HMGB1、TLR4和p-NF-κB p65表達(dá)水平，并能增加NF-κB特異性抑制劑PDTC對(duì)膿毒癥大鼠心肺組織損傷、心肌損傷標(biāo)記物、肺臟W/D比值、血清炎性細(xì)胞因子含量及炎癥通路活化的調(diào)節(jié)作用?？傊?，AG能通過(guò)抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化，減輕膿毒癥大鼠心肺病理?yè)p傷和炎癥反應(yīng)。