宋世磊，丁光偉，閆方博，萬(wàn)磊

（河南科技大學(xué)附屬許昌市中心醫(yī)院1.消化內(nèi)科；2.胃鏡室；3.病理科，河南 許昌 461000）

慢性胃炎是一種常見(jiàn)的由各種原因引起的慢性胃粘膜炎性疾病，其發(fā)病率在各種胃疾病中居首[1]。慢性胃炎的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，但是諸多影響因素如：生活習(xí)慣、遺傳和傳染性因素（幽門螺桿菌）均可導(dǎo)致患慢性胃炎的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。人基質(zhì)金屬肽酶13（MMP-13）是一種蛋白水解酶，由Freij及其團(tuán)隊(duì)在1994發(fā)現(xiàn)[3]。在慢性炎癥引起的頭頸部鱗狀癌，軟骨肉瘤，膀胱移行細(xì)胞癌和口腔粘膜癌中檢測(cè)到MMP-13的表達(dá)[4]。有研究結(jié)果表明，在幾百例癌癥患者中，約有21%的患者表達(dá)了MMP-13 mRNA，在診斷時(shí)所有漿膜浸潤(rùn)的腫瘤均顯示高水平的MMP-13 mRNA，表明MMP-13的表達(dá)在組織炎癥發(fā)展過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用[5]。人基質(zhì)金屬肽酶3（MMP-3）是基質(zhì)金屬肽酶家族中的一員，有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)幽門螺桿菌感染者使用藥物進(jìn)行治療后，在患者病情恢復(fù)的同時(shí)，其血清MMP-3表達(dá)水平也隨之降低[6]。同時(shí)國(guó)外研究報(bào)道，MMP-3表達(dá)量的增加可激活MMP-13上游靶基因，從而促進(jìn)MMP-13的表達(dá)[7]。幽門螺桿菌感染與慢性胃炎的發(fā)生密切相關(guān)，幽門螺桿菌誘導(dǎo)潰瘍和胃炎中TNF-α和IL-1β的分泌，從而刺激胃上皮細(xì)胞中MMP-3和MMP-13的分泌，因此，胃細(xì)胞可能會(huì)受到幽門螺桿菌定植的影響，從而促進(jìn)炎癥并損害胃粘膜[8]。因此本研究以102例慢性胃炎患者為研究對(duì)象，探討MMP-3和MMP-13表達(dá)水平與幽門螺桿菌相關(guān)胃炎的關(guān)系，為臨床幽門螺桿菌相關(guān)胃炎的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院消化科自2019年1月至2020年1月確診的102例慢性胃炎患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴參照《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)（2017，上海）》[9]，胃鏡和病理組織切片活檢確診為慢性胃炎；⑵所選患者具有完整的臨床基礎(chǔ)資料。排出標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者年齡小于18歲；⑵妊娠或哺乳期婦女；⑶近一個(gè)月內(nèi)服用過(guò)抗幽門螺桿菌類藥物；⑷合并患有其他嚴(yán)重胃部疾??；⑸患者存在嚴(yán)重精神障礙，無(wú)法正常溝通交流。根據(jù)14C尿素呼氣試驗(yàn)結(jié)果，將102例慢性胃炎患者分為幽門螺桿菌（H.pylori）陽(yáng)性組和陰性組，其中H.pylori陽(yáng)性組59例，H.pylori陰性組43例。本研究已取得患者本人及家屬知情同意，且通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要試劑 MMP-3（批號(hào)：201549）、MMP-13蛋白抗體（批號(hào)：201544）購(gòu)自武漢Elabscience公司；山羊抗兔二抗（批號(hào)：SW201948）購(gòu)自上海寶生物有限公司；DAB顯色試劑盒（批號(hào)：a847910）購(gòu)自北京萬(wàn)泰德瑞診斷技術(shù)有限公司；進(jìn)口山羊血清（批號(hào)：414587）購(gòu)自鼎國(guó)生物有限公司。

1.3 H-E染色 將組織蠟塊切成5μm，置于防脫載玻片上，經(jīng)脫蠟（二甲苯）、水化（梯度乙醇）處理，蘇木素和伊紅染色2 min,水洗后脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)法 將組織蠟塊切成5μm，置于防脫載玻片上，經(jīng)脫蠟（二甲苯）、水化（梯度乙醇）處理后進(jìn)行如下步驟：⑴PBS溶液浸泡3次，每次5 min，晾干；⑵將切片置于枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS浸泡3次，每次5 min；⑶3%雙氧水浸泡10 min,用于去除內(nèi)源性酶，PBS浸泡3次，每次5 min；⑷每張切片的組織上滴加50μl山羊血清，封閉30 min；⑸棄去山羊血清，不用清洗，加50μl一抗孵育，4℃過(guò)夜；⑹次日，棄去一抗，PBS浸泡3次，每次5 min，晾干，滴加50μl二抗（生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG）孵育30 min；⑺棄去二抗，PBS浸泡3次，每次5 min，滴加DAB顯色劑，鏡下觀察組織顏色，適時(shí)終止；⑻PBS洗去DAB顯色劑，滴加蘇木素復(fù)染約5 min，自來(lái)水沖洗，1%的鹽酸酒精（75%）溶液分化5s，自來(lái)水沖洗5 min藍(lán)化；⑼依次經(jīng)過(guò)70%、80%、90%、95%、無(wú)水乙醇各5 min，二甲苯20 min后用中性樹脂封片。顯微鏡下觀察MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)水平。

1.5 免疫組化結(jié)果判定 采用雙盲法，由兩位未參與前期試驗(yàn)且有病理工作經(jīng)驗(yàn)的工作人員在（×100）視野下對(duì)蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用半定量分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具體計(jì)分方法如：⑴陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率：0分=無(wú)表達(dá)、1分=1%～25%、2分=25%～50%、3分=50%～75%、4分=75%以上；⑵染色強(qiáng)度：0分=無(wú)顏色、1分=淺黃色、2分=黃色、3分=棕黃色。兩者得分相乘作為最后得分，≥2分為表達(dá)陽(yáng)性，＜2分則為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例頻數(shù)/百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，危險(xiǎn)因素分析采用Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 102例慢性胃炎患者中H.pylori陰性組43例（42.16%）,其中男性25例（58.14%）,女性18例（41.86%），年齡23～65，平均年齡（41.15±7.07）歲；H.pylori陽(yáng)性組59例（57.84%），其中男性37例（62.71%），女性22例（37.29%），年齡24～67歲，平均年齡（41.51±7.11）歲，H.pylori陰性和H.pylori陽(yáng)性患者性別構(gòu)成比和年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 HE染色結(jié)果 有病理結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，H.pylori陰性組患者胃粘膜有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)伴有少量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)；而H.pylori陽(yáng)性組患者胃粘膜大部分腸化生，固有腺體減少，同時(shí)組織結(jié)構(gòu)大量被破壞，并伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組患者胃組織病理鏡下表現(xiàn)（蘇木素-伊紅染色，×40）

2.3 兩組患者M(jìn)MP-3、MMP-13蛋白表達(dá)水平比較 兩種蛋白的表達(dá)均位于細(xì)胞核內(nèi)，與H.pylori陰性組比較，H.pylori陽(yáng)性組MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1和圖2。

圖2 兩組患者胃組織鏡下MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)水平（免疫組織化學(xué)，×200）

表1 兩組患者M(jìn)MP-3、MMP-13蛋白表達(dá)水平比較[n（%）]

2.4 MMP-3、MMP-13表達(dá)水平與患者基礎(chǔ)指標(biāo)的關(guān)系 通過(guò)比較不同年齡、性別、吸煙史和飲酒史患者發(fā)現(xiàn)，其胃組織中MMP-3、MMP-13表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 胃組織中MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)情況和臨床基礎(chǔ)指標(biāo)的關(guān)系[n（%）]

3 討論

胃炎是臨床上常見(jiàn)的消化道疾病，根據(jù)病理和病程特點(diǎn)，胃炎常分為急性胃炎和慢性胃炎兩大類。其中慢性胃炎的發(fā)生率較高，治療藥物種類繁多，但治療效果較差，很容易復(fù)發(fā)[10]。慢性胃炎的病因和機(jī)制非常復(fù)雜，通常是由多種因素引起的，其中氧自由基破壞胃粘膜的假設(shè)已逐漸為人們所接受。氧自由基是重要的致病因子，主要通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化和共價(jià)鍵結(jié)合引起胃粘膜損傷[11]。胃粘膜損傷是由于胃粘膜防御功能和損傷因子之間的平衡被破壞，最終導(dǎo)致胃的急慢性炎癥性損傷[12]。研究證實(shí)，慢性胃炎患者更容易患胃癌。此外，慢性胃炎的炎癥活動(dòng)期被認(rèn)為是浸潤(rùn)性胃癌癌前病變的第一階段。因此，為了預(yù)防疾病的發(fā)展，慢性胃炎應(yīng)引起足夠的重視并得到治療[13]。幽門螺桿菌誘發(fā)慢性胃炎的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，但是在幽門螺桿菌的目前已知研究中發(fā)現(xiàn)，可產(chǎn)生多種毒力因子。有研究顯示，在小鼠感染幽門螺桿菌后，其胃粘膜發(fā)生不典型增生和萎縮的時(shí)間明顯早于無(wú)幽門螺桿菌感染的小鼠，說(shuō)明幽門螺桿菌感染可加重慢性胃炎的病情[14]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng),分化,凋亡,侵襲,轉(zhuǎn)移，血管生成和免疫監(jiān)視，在疾病發(fā)展的多個(gè)步驟中起重要作用[15]。目前MMPs家族成員已鑒別出MMP1～26共計(jì)26種，根據(jù)其同源性，可分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素和基質(zhì)溶解素等6大類，其中已被證實(shí)MMP-3可激活MMPs家族其他成員。MMP-3為一種基質(zhì)溶解素，其作用是分解細(xì)胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致外界環(huán)境中的病原菌更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而加速疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。MMP-13，也稱為人膠原酶-3，被認(rèn)為在多種炎性疾病的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在早期骨關(guān)節(jié)炎中，MMP-13的表達(dá)和含量均顯著上升,且隨著疾病的進(jìn)程呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[17]。但是目前關(guān)于MMP-3與MMP-13蛋白在慢性胃炎中的研究還鮮有報(bào)道，但是同作為MMPs家族中的一員，其表達(dá)也存在一定的關(guān)聯(lián)性。在正常細(xì)胞中，MMP-13的表達(dá)水平一般相對(duì)較低，但是有研究發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)炎等疾病中，MMP-3蛋白表達(dá)水平的增加，可促進(jìn)MMP-13蛋白的高表達(dá)，從而引起疾病向不利于轉(zhuǎn)歸的方向發(fā)展[18]。

在本研究中，與未感染幽門螺桿菌的胃炎患者相比，感染幽門螺桿菌的胃炎患者胃粘膜大部分腸化生，固有腺體減少，同時(shí)組織結(jié)構(gòu)大量被破壞，并伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明較普通胃炎患者，在感染幽門螺桿菌后，其對(duì)患者機(jī)體損傷更加嚴(yán)重。對(duì)比H.pylori陰性組和陽(yáng)性組發(fā)現(xiàn)，H.pylori陽(yáng)性組MMP-3與MMP-13蛋白表達(dá)水平均顯著高于H.pylori陰性組，結(jié)合病理結(jié)果，進(jìn)一步反應(yīng)了幽門螺桿菌對(duì)機(jī)體的損傷嚴(yán)重程度，其機(jī)制可能是幽門螺桿菌通過(guò)產(chǎn)生某些毒力因子，從而促進(jìn)機(jī)體MMP-3的蛋白表達(dá)增加，同時(shí)MMP-3靶向調(diào)控MMP-13蛋白表達(dá)水平，是MMP-13表達(dá)水平增加，MMP-3與MMP-13蛋白表達(dá)增加后，促進(jìn)機(jī)體炎癥水平的加重，從而使疾病向不利于轉(zhuǎn)歸的方向發(fā)展。同時(shí)本研究也分析了不同年齡、性別、吸煙和飲酒史患者的MMP-3與MMP-13蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示MMP-3與MMP-13蛋白表達(dá)水平與患者年齡、性別及生活習(xí)慣并無(wú)相關(guān)性，因此也可更進(jìn)一步的說(shuō)明MMP-3和MMP-13蛋白的表達(dá)水平可能是受到了幽門螺桿菌的影響。

綜上，MMP-3與MMP-13可能參與了幽門螺桿菌致炎過(guò)程，幽門螺桿菌可能導(dǎo)致了其異常表達(dá)，從而促進(jìn)了胃粘膜上皮細(xì)胞增殖紊亂的發(fā)生，使患者炎癥加重，這可能是幽門螺桿菌治病的可能機(jī)制之一，有望為臨床幽門螺桿菌引起的慢性胃炎提供治療靶點(diǎn)。