蓋李樂(lè)，袁 丁，張長(zhǎng)城，夏宗保，石 越，高 艷，袁成福*

1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌 443000；2荊門(mén)市第一人民醫(yī)院，荊門(mén) 448000

隨著人口老齡化的到來(lái)，年齡相關(guān)性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)，經(jīng)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，近10年來(lái)慢性腎病的患病率已高達(dá)10%[1]。腎臟是人體最重要的代謝器官之一，在維持正常的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。隨著年齡增長(zhǎng)，衰老所伴隨發(fā)生的腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化，使得腎臟結(jié)構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，腎功能進(jìn)行性惡化甚至喪失[2-4]。腎纖維化是慢性腎病的終末期表現(xiàn)，一旦發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量以及生存時(shí)間，因此，尋找防治衰老相關(guān)纖維化的有效藥物具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義，積極地改善腎臟組織慢性損傷和纖維化，是防治慢性腎病的重要環(huán)節(jié)。

淫羊藿(Herba Epimedii)又名仙靈脾，是一味常見(jiàn)的傳統(tǒng)天然補(bǔ)腎中藥，性溫，走肝腎二經(jīng)，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕之功效，其藥用歷史悠久[5]。淫羊藿總黃酮(total flavonoids of Herba Epimedii，TFE)是淫羊藿的有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，TFE具有改善骨質(zhì)疏松[6]、心血管疾病[7]、睪丸病變[8]的功效，同時(shí)可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗氧化、抗炎等多種途徑來(lái)抵抗衰老[9]，具有較大的研究?jī)r(jià)值。本課題組前期研究顯示，TFE能通過(guò)調(diào)節(jié)IRE1α/XBP1信號(hào)通路改善自然衰老大鼠睪丸支持細(xì)胞的分泌功能[10]；TFE還可通過(guò)抑制MAPK/NFκB信號(hào)通路改善自然衰老大鼠的腦部炎癥，延緩腦衰老[11]。多項(xiàng)報(bào)道顯示淫羊藿能夠有效抵抗多部位臟器衰老，然而其能否改善腎臟衰老所致的纖維化卻鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)觀察TFE對(duì)自然衰老大鼠腎臟形態(tài)、功能以及αSMA、TGFβ1、Smad3蛋白表達(dá)水平的影響，來(lái)探討TFE對(duì)自然衰老大鼠腎臟組織纖維化的影響及其作用機(jī)制，為豐富淫羊藿在衰老相關(guān)性疾病的防治提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

淫羊藿總黃酮購(gòu)于成都仁誠(chéng)生物科技有限公司，其純度為80%，用1%羥甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)配置成相應(yīng)濃度的溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雄性SD大鼠18月齡36只、2月齡10只，購(gòu)自北京維通利華技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，分籠飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障系統(tǒng)，溫度22±2 ℃，濕度60%±5%，光照明暗交替，飼養(yǎng)期間大鼠均自由攝食飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(大連寶生物科技有限公司)；PCR引物(生工生物工程股份有限公司)；SOD試劑盒、MDA試劑盒、Masson染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)；β-actin抗體(美國(guó)Santa cruz公司)；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，αSMA)抗體(美國(guó)Santa cruz公司)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)抗體(美國(guó)Abcam公司)；Smad3抗體(美國(guó)CST公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

MICROM GmbHHM340E超薄切片機(jī)(德國(guó)MICROM)；StepOnePlusTM實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosysterms)；TYPE1500-458全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Electron)；PowerPacTMBasic電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)；Bioshine ChemiQ4800化學(xué)發(fā)光成像自動(dòng)顯影儀(中國(guó)歐翔科學(xué)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將36只18月齡雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為3組：自然衰老組、TFE低劑量組(10 mg/kg)、TFE高劑量組(40 mg/kg)，每組12只，10只2月齡大鼠為青年對(duì)照組。每日定時(shí)給予大鼠灌胃1次，共計(jì)給藥4個(gè)月。根據(jù)大鼠體重，TFE低、高劑量組給予相對(duì)應(yīng)濃度的藥物灌胃，青年對(duì)照組及自然衰老組分別給予體重相對(duì)應(yīng)的1% CMC-Na溶液灌胃，每周稱(chēng)量一次體重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃容量。

2.2 腎臟組織的收集及保存

大鼠喂養(yǎng)4個(gè)月后，在取材前稱(chēng)量大鼠體重；麻醉后用脫頸法處死，組織剪沿皮膚及皮下組織各層剖開(kāi)胸腹腔，迅速摘取大鼠腎臟等組織，用預(yù)冷的PBS清洗后濾紙吸干多余液體，一部分腎臟組織過(guò)液氮后凍存在-80 ℃，另一部分腎臟縱行切開(kāi)后浸泡于4%多聚甲醛用于HE染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)。

2.3 HE染色和Masson染色觀察腎臟組織形態(tài)和膠原沉積

腎臟標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，經(jīng)蘇木精和伊紅染色(HE staining)后在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理改變，Masson染色評(píng)估腎臟組織膠原沉積情況。在200倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，呈現(xiàn)藍(lán)色的區(qū)域?yàn)槟z原纖維，藍(lán)色區(qū)域的面積與整個(gè)視野總面積的比值為腎臟纖維化指數(shù)。采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析。

2.4 檢測(cè)腎臟組織SOD活力及MDA含量

稱(chēng)取100 mg腎臟組織，加入1 mL預(yù)冷的PBS緩沖液制備成10%勻漿，用冰凍離心機(jī)4 ℃ 3 500 rpm離心15 min，吸取上清液，按照試劑盒步驟，分別采用黃嘌呤氧化酶法和TBA法檢測(cè)腎臟組中的SOD活力和MDA含量。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平

稱(chēng)取40 mg腎臟組織，加入Trizol充分裂解，再依次加氯仿、異丙醇、75%乙醇抽提RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，核酸儀檢測(cè)RNA濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反應(yīng)體系為：SYBR 5 μL，超純水3.4 μL，引物0.4 μL(上、下游引物各0.2 μL)，Dye 0.2 μL，cDNA 1 μL，在ABI StepOneplusTM儀器進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本2個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計(jì)算出目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

2.6 免疫組化法檢測(cè)大鼠腎臟組織αSMA的表達(dá)

腎臟組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，檸檬酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)10 min，PBS沖洗后滴加3%過(guò)氧化氫37 ℃孵育10 min，再PBS沖洗，用5% BSA室溫下封閉1 h，滴加一抗(1∶200)4℃孵育過(guò)夜后滴加二抗，室溫孵育1 h，PBS沖洗3遍，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化后，自來(lái)水沖洗，干燥后封片。鏡下觀察到陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色，在200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，用Image Pro Plus 6.0軟件分析陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)面積。

2.7 Western blot檢測(cè)腎臟組織TGF-β1及Smad3的蛋白水平表達(dá)

稱(chēng)取40 mg腎臟組織，加入裂解液高速研磨30 s，渦旋儀振蕩15 s，冰上靜置10 min，重復(fù)3次，4 ℃下12 000 rpm離心15 min，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸10 min。制備SDS-PAGE凝膠，電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%牛奶室溫下封閉1 h，4 ℃下一抗孵育過(guò)夜，TBST洗膜后在室溫下孵育二抗1 h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 TFE對(duì)自然衰老大鼠腎臟組織病理形態(tài)的影響

如圖1HE染色圖片所示，與青年對(duì)照組相比，自然衰老組大鼠腎臟腎小球血管袢增生，腎小管擴(kuò)張，廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部有點(diǎn)片狀萎縮壞死，大量膠原纖維增生；而與自然衰老組相比，TFE低、高劑量組大鼠腎臟組織中腎小管擴(kuò)張程度減輕，炎性細(xì)胞數(shù)量減少，膠原纖維明顯減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善。

3.2 TFE對(duì)自然衰老大鼠腎臟組織膠原沉積的影響

由圖2 Masson染色可見(jiàn)，腎臟組織中腎小球上皮細(xì)胞胞漿、間質(zhì)細(xì)胞胞漿等呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。與青年對(duì)照組比較，自然衰老組膠原纖維明顯增多(P< 0.05)，而TFE組腎臟組織中的膠原纖維較自然衰老組減少，且高劑量組效果顯著(P< 0.05)。

3.3 TEF對(duì)自然衰老大鼠腎臟組織SOD活力的影響

如圖3所示，與青年對(duì)照組相比，自然衰老組SOD活力顯著下降，而MDA的含量在自然衰老組大鼠腎臟組織中明顯上升(P< 0.05)，TFE組較自然衰老組SOD活力升高，MDA含量用藥后下降，且高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

3.4 TFE對(duì)自然衰老大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)的影響

如圖4所示，與青年對(duì)照組相比，自然衰老組TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)明顯增加(P< 0.05)，而TFE組較自然衰老組顯著降低(P< 0.05)。

圖1 HE淫羊藿總黃酮對(duì)腎臟組織形態(tài)的影響(× 200)Fig.1 The effects of TFE on morphology of kidney slice of rats (× 200 )注：箭頭所示為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。A：青年對(duì)照組；B：自然衰老組；C：淫羊藿總黃酮低劑量組；D：淫羊藿總黃酮高劑量組(下同)。Note:The arrows indicate inflammatory cell infiltration.A is the young contro groupl;B is the natural aging group;C is the low-dose group of TFE;D is the high-dose group of TFE (the same below).

圖2 淫羊藿總黃酮對(duì)腎臟組織膠原纖維沉積的影響Fig.2 The effects of TFE on collagenous fiber in kidney slice of rats s,n = 9-11 )注：與青年對(duì)照組比較，*P< 0.05；與自然衰老組比較，#P < 0.05(下同)。Note:Compared with young control group,*P< 0.05;Compared with natural aging group,#P < 0.05 (the same below).

3.5 TFE對(duì)自然衰老大鼠腎臟組織αSMA蛋白表達(dá)的影響

如圖5免疫熒光結(jié)果所示，與青年對(duì)照組相比，自然衰老組腎臟αSMA陽(yáng)性表達(dá)明顯增加(棕黃色部分)(P< 0.05)，而經(jīng)TFE給藥組較自然衰老組降低，且高劑量組效果更為顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

3.6 TFE對(duì)自然衰老大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與青年對(duì)照組相比，自然衰老組TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)明顯增加，TFE組較自然衰老組明顯降低(P< 0.05)。

圖3 淫羊藿總黃酮對(duì)大鼠腎臟SOD活力和MDA含量的影響Fig.3 The effects of TFE on SOD vitality and the content of MDA in kidney of rats s,n = 9-11 )

圖4 淫羊藿總黃酮對(duì)腎臟組織中TGF-β1和Smad3的mRNA水平的影響Fig.4 The effects of TFE on the mRNA level of TGF-β1 and Smad3 in kidney s,n = 9-11)

圖5 淫羊藿總黃酮對(duì)腎臟組織中αSMA蛋白表達(dá)的影響 Fig.5 The effects of TFE on the protein expression of αSMA in kidney s,n = 9-11 )

4 討論

目前，我國(guó)老年人占總?cè)丝跀?shù)的百分比已高達(dá)17%，老齡化是慢性腎臟疾病的主要因素之一，且老年患者并發(fā)癥的發(fā)生率也成倍增長(zhǎng)，腎臟疾病的發(fā)生及發(fā)展將嚴(yán)重威脅到老年人口的生存時(shí)間和質(zhì)量[12]。因此，探尋有效的干預(yù)措施,對(duì)慢性腎病患者的轉(zhuǎn)歸有一定的改善作用，而對(duì)于衰老過(guò)程而言，預(yù)防腎臟衰老可能是防治老年性腎臟疾病的途徑之一。

圖6 淫羊藿總黃酮對(duì)腎臟組織中TGF-β1/Smad3信號(hào)通路中蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The effects of TFE on the protein expression of TGF-β1 and Smad3 in kidney s,n = 9-11 )

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多種慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期的一種病理表現(xiàn)，也是衰老腎臟的主要表現(xiàn)之一和導(dǎo)致腎衰竭的主要原因之一[13]。腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，αSMA作為一種高度特異性的轉(zhuǎn)分化標(biāo)記物，是纖維化發(fā)生的標(biāo)記物之一[14]。通過(guò)HE染色和Masson染色可以觀察到，自然衰老大鼠腎臟組織中的膠原纖維明顯增多，免疫組化顯示αSMA表達(dá)量顯著升高，給予不同濃度淫羊藿總黃酮灌胃處理后，腎臟組織中膠原纖維含量減少，αSMA表達(dá)量下降，且高劑量組效果顯著，表明TFE能通過(guò)減少膠原纖維的產(chǎn)生而改善腎間質(zhì)纖維化。

隨著年齡的增加，抗氧化能力逐步下降，機(jī)體自由基的產(chǎn)生和消除能力失衡，氧自由基不斷蓄積，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，功能下降[15,16]。SOD是一種抗氧化酶，以自由基為底物，與O2結(jié)合生成H2O2，是清除體內(nèi)氧自由基的主要物質(zhì)[17]。氧自由基通過(guò)誘發(fā)多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化形成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物，引起細(xì)胞損傷。MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，與SOD共同反映抗氧化能力。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與青年大鼠相比，自然衰老大鼠腎臟組織中SOD活力明顯下降，MDA含量升高，而給予淫羊藿總黃酮灌胃組的大鼠SOD活力較模型組增加，MDA含量下降。這說(shuō)明衰老大鼠的抗氧化能力下降，而給予TFE灌胃后抗氧化能力較之提升。

伴隨著衰老的發(fā)生，機(jī)體代謝的代償能力逐漸衰弱，細(xì)胞受到代謝產(chǎn)物的刺激后活化，產(chǎn)生一系列炎性因子，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的產(chǎn)生和浸潤(rùn)[18]。我們通過(guò)HE染色還可以觀察到，衰老大鼠腎臟組織中有廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，淫羊藿總黃酮處理組中的炎性浸潤(rùn)明顯減少，說(shuō)明淫羊藿總黃酮能通過(guò)減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)起到保護(hù)腎臟的作用。這與前期夏世金[19]、韓桂芳[20]等研究報(bào)道的淫羊藿總黃酮的抗炎作用相似。

TGF-β是一種強(qiáng)致腎小球硬化和腎纖維化的細(xì)胞因子[18]，其主要通過(guò)促進(jìn)炎性細(xì)胞的募集和活化，介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化以及促進(jìn)細(xì)胞外機(jī)制的合成與沉積[21,22]。Smad蛋白是TGF-β受體的胞內(nèi)激酶底物[23]，作為T(mén)GF-β信號(hào)的重要中介，它能夠通過(guò)TGF-β的早期靶基因的DNA結(jié)合特征域，直接激活編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因。因此，TGF-β/Smad信號(hào)通路在慢性腎纖維化損傷進(jìn)程中起著重要作用[23]。這說(shuō)明找到針對(duì)TGF-β1這一靶點(diǎn)的有效藥物，有極大可能改善纖維化進(jìn)展。在本項(xiàng)研究中，自然衰老大鼠腎臟組織中TGF-β1和Smad3的mRNA及蛋白水平均明顯升高，而給予TFE灌胃處理后降低，且高劑量效果顯著。這提示淫羊藿總黃酮可能通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)，減少Smad3的表達(dá)，起到改善腎臟組織纖維化的作用。

綜上所述，TFE具有改善自然衰老SD大鼠腎臟纖維化的作用，其可能機(jī)制與降低自然衰老大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad3和αSMA的蛋白表達(dá)水平有關(guān)，以及通過(guò)減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、減輕氧化應(yīng)激對(duì)腎臟造成的損傷，從而改善衰老腎臟纖維化。目前已有研究證實(shí)淫羊藿總黃酮在多部位臟器中具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，但尚未有研究報(bào)道其在腎臟組織中具有改善衰老所致的纖維化作用，而腎臟組織是機(jī)體代謝的重要參與者，因此，本研究具有一定的創(chuàng)新性和應(yīng)用價(jià)值，為淫羊藿在衰老腎臟纖維化等相關(guān)一系列疾病的臨床防治中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和應(yīng)用依據(jù)。