郭 松，陳正陽，楊佳啟，柴韶斌，徐冰心，孫宏偉，周金蓮，楊鶴鳴，崔 彥

外太空是一個集失重、輻射、高磁場、超低溫等因素的復(fù)雜環(huán)境，充斥著威脅航天員生命與健康的不穩(wěn)定因素。隨著載人航天事業(yè)的飛速發(fā)展，微重力環(huán)境對機體的影響備受關(guān)注[1-2]。研究證實，微重力環(huán)境會對消化系統(tǒng)產(chǎn)生一系列不良影響，包括對消化液和消化道激素分泌、胃腸黏膜屏障、腸道微生態(tài)、胃腸道血液及淋巴循環(huán)、藥物動力學(xué)、藥物效應(yīng)動力學(xué)及對肝臟、胰腺功能的影響等。保障航天員在執(zhí)行航天任務(wù)及進行模擬微重力環(huán)境訓(xùn)練過程中消化系統(tǒng)的穩(wěn)定狀態(tài)，明確微重力環(huán)境對消化系統(tǒng)影響的機制，均亟待深入研究[3-4]。本課題在前期研究[5-7]的基礎(chǔ)上，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(rotary cell culture system， RCCS)，研究模擬微重力環(huán)境對人胃黏膜上皮GES-1細胞代謝組學(xué)的影響，以期為未來基于微重力環(huán)境下代謝組學(xué)變化特征探討胃黏膜上皮相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展機制及應(yīng)對措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 人胃黏膜上皮GES-1細胞系(賽百慷生物技術(shù)股份有限公司)，RCCS(Synthecon，USA)，10 ml高截面縱橫比容器-D410(Synthecon，USA)，Cytodex-3微載體(Sigma，USA)，TCP-SP5-Ⅱ激光共聚焦顯微鏡(Leica Microsystems，Wetzlar，GER)，超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(AB SCIEX，USA)。

1.2GES-1細胞培養(yǎng)和實驗分組 配制含10%胎牛血清，1%青霉素100 U/ml和鏈霉素100 mg/ml的DMEM培養(yǎng)基，選取3～10代處于對數(shù)生長期的人胃黏膜上皮GES-1細胞進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的人胃黏膜上皮GES-1細胞隨機分為模擬微重力組(SMG組)和正常重力對照組(NG組)。

1.3RCCS模擬微重力細胞培養(yǎng) 將人胃黏膜上皮GES-1細胞以1×106個/ml密度與經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、75%乙醇預(yù)處理的Cytodex-3微載體0.05 g混合，置入高截面縱橫比容器-D410并連接RCCS。SMG組的高截面縱橫比容器-D410軸心與地面平行，NG組于正常重力環(huán)境中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速設(shè)置為12 r/min。

1.4樣本采集 細胞培養(yǎng)1、3和5 d收集樣本。SMG組用5 ml注射器吸取高截面縱橫比容器-D410中的混合液體于15 ml離心管內(nèi)，待細胞-微載體復(fù)合物沉淀后棄去上清液，用PBS溶液沖洗細胞-微載體復(fù)合物2遍，棄去上清液，隨后加入0.25%胰酶消化液2 ml，37℃消化5 min，1000 r/min離心5 min，用吸管吹打，使微載體上的細胞脫落，用70 μm細胞篩過濾，獲取單細胞懸液。NG組棄上清液，用PBS溶液沖洗2遍，后加入0.25%胰酶消化液2 ml，37℃消化5 min，獲取單細胞懸液。將2組單細胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清液，用液氮速凍后置-80℃冰箱待測。每組樣本進行6次生物學(xué)重復(fù)。

1.5樣品處理 取等量細胞樣品，加入提取液(甲醇︰乙腈︰水=2︰2 ︰ 1)1000 μl；經(jīng)高通量組織破碎儀破碎(-20℃，60 Hz)，渦旋(30 s)混勻后，低溫超聲萃取10 min，重復(fù)3次，超聲萃取參數(shù)為5℃、40 kHz；再將樣品靜置于-20℃環(huán)境中30 min，在4℃、13 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，復(fù)溶液(乙腈︰水=1︰1)100 μl復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進樣小瓶中上機進行檢測。

1.6LC/MS檢測 分析平臺為超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，色譜條件：色譜柱BEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d，1.7 μm)，流動相A為水(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈/異丙醇(1/1)，設(shè)定流速為0.40 ml/min、進樣量為20 μl、柱溫為40℃。樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負離子掃描模式，離子噴霧電壓。樣本洗脫梯度見表1，質(zhì)譜源參數(shù)及碰撞能見表2。

表1 流動相洗脫梯度

表2 質(zhì)譜源參數(shù)及碰撞能

1.7數(shù)據(jù)分析 將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI進行基線過濾、峰識別及積分，保留時間校正、峰對齊，得到保留時間、質(zhì)荷比和峰強度的數(shù)據(jù)矩陣，進行數(shù)據(jù)預(yù)處理：保留至少一組樣品中非零值80%以上的變量；原始矩陣中最小值填補缺失值；總峰歸一化，刪除QC樣本相對標準偏差>30%的變量，獲取用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。Progenesis QI搜庫鑒定，將質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進行匹配。主要數(shù)據(jù)庫為http://www.hmdb.ca/和https://metlin.scripps.edu。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用主成分分析(principal component analysis, PCA)，R2X>0.5說明PCA模型效果好，預(yù)測能力強。應(yīng)用正交偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)探討組間差異。變量重要性(VIP)評價自變量在解釋因變量時作用的重要性，篩選VIP>1的變量作為差異代謝物或潛在標志物。采用t檢驗結(jié)合多元OPLS-DA分析，篩選出2組間差異代謝物(同時滿足VIP>1，P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1PCA分析 采用PCA建立模型，對樣本進行PCA分析，培養(yǎng)1、3、5 d的2組樣本模型參數(shù)分別為R2X=0.712、R2X=0.692、R2X=0.624，3個時間點R2X均>0.5。培養(yǎng)1、3、5 d樣本的PCA分析得分見圖1，2組不同培養(yǎng)時相分別聚類，每組的橢圓分離，表明模擬微重力環(huán)境對人胃黏膜上皮GES-1細胞的代謝產(chǎn)生影響；代謝物之間分離聚類，表明代謝物可作為潛在的生物標志物。

圖1 旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)對模擬微重力環(huán)境下人胃黏膜上皮GES-1細胞主成分分析圖

2.2OPLS-DA分析 對培養(yǎng)細胞樣本進行OPLS-DA分析，結(jié)果顯示，培養(yǎng)1、3、5 d的2組樣本模型參數(shù)分別為R2Y=0.919、Q2=0.892，R2Y=0.957、Q2=0.944，R2Y=0.946、Q2=0.933,3個時間點模型參數(shù)均>0.5。培養(yǎng)1、3、5 d的2組代謝產(chǎn)物聚類明顯分離，見圖2，表明代謝產(chǎn)物有明顯差異。對樣本進行置換檢驗，以進一步檢驗OPLS-DA模型的預(yù)測性能，見圖3。經(jīng)200次置換檢驗，得出R2=0.6018，Q2=-0.2192，數(shù)值均<1，表明模型穩(wěn)定，預(yù)測性良好。

圖2 旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)對模擬微重力環(huán)境下人胃黏膜上皮GES-1細胞正交偏最小二乘判別分析

圖3 旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)對模擬微重力環(huán)境下人胃黏膜上皮GES-1細胞正交偏最小二乘判別分析置換檢驗結(jié)果

2.3差異代謝物篩選 對2組1、3、5 d的代謝產(chǎn)物采用多元OPLS-DA分析結(jié)合t檢驗，篩選出202種差異代謝物，2組培養(yǎng)1 d有151種差異代謝物，其中113種表達上調(diào)，38種表達下調(diào)；2組培養(yǎng)3 d有134種差異代謝物，其中109種表達上調(diào)，25種表達下調(diào)；2組培養(yǎng)5 d有154種差異代謝物，其中131種表達上調(diào)，23種表達下調(diào)。

2.4差異代謝物分析 將2組差異代謝物數(shù)據(jù)進行代謝物分析，通過Venn圖篩選出2組1、3、5 d的共同差異代謝物(VIP>1且P<0.05)74種，其中57種表達上調(diào)，17種表達下調(diào)，見圖4。通過KEGG數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)有具體名稱及相關(guān)功能的差異代謝物44種，主要包括磷脂、氨基酸、輔助因子及羧酸，見圖5。通過HMDB數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)這些代謝物的亞分類主要包括甘油磷脂酰膽堿(21.74%)、甘油磷脂酰乙醇胺(19.57%)、氨基酸及肽類(17.39%)等，見圖6。KEGG數(shù)據(jù)庫富集通路分析結(jié)果顯示，差異代謝物涉及脂類代謝、氨基酸代謝、輔酶和維生素代謝、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、細胞增殖和凋亡、腫瘤調(diào)控、膜轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)等信號通路，見圖7。44種差異代謝物中31種表達上調(diào)，13種表達下調(diào)。磷脂類中磷脂酰膽堿有4種表達上調(diào)，2種表達下調(diào)；磷脂酰乙醇胺有5種表達上調(diào)，1種表達下調(diào)；磷脂酰甘油有2種表達上調(diào)；磷脂酰絲氨酸有2種表達下調(diào)；溶血磷脂共9種，表達皆上調(diào)；鞘脂類中鞘磷脂表達下調(diào)，鞘氨醇和鞘氨醇半乳糖表達上調(diào)，見表3。

表3 培養(yǎng)1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞共同差異代謝物

圖4 培養(yǎng)1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞共同差異代謝物Venn圖

圖5 培養(yǎng)1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞差異代謝物KEGG數(shù)據(jù)庫化合物分類

圖6 培養(yǎng)1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞差異代謝物HMDB數(shù)據(jù)庫化合物分類

圖7 培養(yǎng)1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1細胞差異代謝物KEGG數(shù)據(jù)庫富集通路分析

3 討論

GES-1細胞系為原代培養(yǎng)的胎兒正常胃黏膜上皮細胞,經(jīng)過SV40病毒感染并經(jīng)轉(zhuǎn)化分離后建立的可在體外長期穩(wěn)定傳代的細胞系。除了良好的轉(zhuǎn)化特性外，GES-1細胞還保留了正常的細胞骨架結(jié)構(gòu)，如微絲、微管、角蛋白，其黏蛋白反應(yīng)陽性，以單層形式貼壁生長，可以在體外長期傳代，是一種比較理想的研究人胃黏膜正常上皮細胞的體外模型細胞[8-9]。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，可對生物體內(nèi)廣譜代謝產(chǎn)物進行定量分析并發(fā)現(xiàn)不同狀態(tài)下代謝產(chǎn)物的變化，從而明確生物體不同代謝產(chǎn)物與相應(yīng)生理、病理狀態(tài)的關(guān)系，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各領(lǐng)域，為詮釋生命現(xiàn)象、探尋疾病機制、研發(fā)藥物、發(fā)現(xiàn)生物學(xué)標志物等提供了強大的技術(shù)平臺，展現(xiàn)了嶄新的理論視角[10]。

本實驗應(yīng)用代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，RCCS模擬微重力環(huán)境對人胃黏膜上皮GES-1細胞的代謝產(chǎn)生明顯影響，其中對于脂質(zhì)代謝物及脂質(zhì)代謝通路的影響尤為顯著。模擬微重力環(huán)境使人胃黏膜上皮GES-1細胞的溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、硬脂酰肉堿等表達增加，而鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰單甲基乙醇胺、油酰胺等表達減少?，F(xiàn)已明確，這些脂類代謝物是構(gòu)成細胞膜結(jié)構(gòu)的主要成分，與其穩(wěn)定性和發(fā)揮正常功能密切相關(guān)。磷脂酰膽堿是構(gòu)成細胞膜結(jié)構(gòu)的主要成分，而溶血磷脂酰膽堿在膜上發(fā)揮溶解作用。溶血磷脂酰絲氨酸可誘導(dǎo)胃腔分泌型磷脂酶A2活性增加,其產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿能夠直接破壞胃的疏水層，并且可能導(dǎo)致胃屏障的破壞和炎癥的發(fā)生[11-12]。本課題組前期研究RCCS模擬微重力環(huán)境對人角化細胞及表皮干細胞代謝組學(xué)的影響，同樣發(fā)現(xiàn)模似微重力環(huán)境導(dǎo)致細胞的多種脂質(zhì)代謝失調(diào)，并涉及細胞的氨基酸代謝通路、膜轉(zhuǎn)運通路及脂質(zhì)代謝通路等[13-14]。細胞膜結(jié)構(gòu)包括細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜、核膜、線粒體膜、溶酶體膜等，均以磷脂雙分子層為基本骨架。暴露于微重力環(huán)境中的細胞膜結(jié)構(gòu)變化，早年即引起學(xué)術(shù)界的關(guān)注，但相關(guān)機制一直未能明確[15-16]。郭彪等[5]進行尾懸吊模擬失重大鼠實驗，發(fā)現(xiàn)失重可導(dǎo)致胃黏膜超微結(jié)構(gòu)改變及氧化應(yīng)激損傷，持續(xù)尾懸吊可導(dǎo)致胃黏膜細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，超微結(jié)構(gòu)異常，胃黏膜層變薄，分泌及屏障功能受損。結(jié)合文獻分析認為，微重力環(huán)境下人胃黏膜上皮GES-1細胞脂質(zhì)代謝發(fā)生變化，影響細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，達到一定閾值將導(dǎo)致膜屏障功能受損、細胞內(nèi)環(huán)境紊亂、物質(zhì)和能量交換及信息傳遞障礙、藥物代謝受影響[17]等一系列問題。

本研究結(jié)果還提示，在RCCS模擬微重力環(huán)境中人胃黏膜上皮GES-1細胞的增殖、分化、凋亡發(fā)生變化。代謝物變化包括PE(18∶1(11Z)/15∶0)表達增加；SM(d18∶0/16∶1(9Z))表達減少，而其代謝產(chǎn)物Sphingosine和Galactosylsphingosine表達增加；L-谷氨酸、D-色氨酸、酪氨酸、酪氨酰色氨酸、賴氨酰纈氨酸、谷胱甘肽、2-(S-谷胱甘肽)乙?；入赘孰?、L-異亮氨酸和纈氨酸等氨基酸類化合物表達亦增加。KEGG數(shù)據(jù)庫富集通路分析亦顯示，模擬微重力環(huán)境中人胃黏膜上皮GES-1細胞的差異代謝物涉及細胞增殖和凋亡通路。已有研究證實，人和哺乳類動物的質(zhì)膜中富含磷脂酰乙醇胺，其已成為細胞凋亡分子檢測研究的重要目標[18]。鞘脂是一類具有廣泛生理功能和病理作用的脂類物質(zhì)，而鞘磷脂為細胞鞘脂的主要成分，在細胞的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和細胞功能方面發(fā)揮重要作用，受鞘磷脂代謝通路調(diào)控，參與細胞的增殖、生長、凋亡及炎癥修復(fù)[19-20]。據(jù)Zhu等[21]研究報道，回轉(zhuǎn)器模擬微重力環(huán)境使胃癌SGC-7901細胞72 h時凋亡增加，胃黏膜上皮HFE-145細胞在12 h時凋亡即顯著增加。顯然，在微重力這一極為特殊的環(huán)境刺激下，機體細胞會發(fā)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，而凋亡變化則為一種普遍存在的生理/病理現(xiàn)象，在應(yīng)激反應(yīng)和代償/失代償生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[22]。中長期微重力環(huán)境對胃黏膜上皮細胞增殖、分化和凋亡的影響及機制尚待進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤和炎癥相關(guān)聯(lián)的代謝物亦發(fā)生變化。胃腸道腫瘤和炎性細胞含有活化的鞘脂代謝酶，包括鞘氨醇激酶1和鞘氨醇激酶2，它們會產(chǎn)生具有高生物活性的鞘氨醇-1-磷酸，一般炎癥反應(yīng)與循環(huán)鞘氨醇-1-磷酸有關(guān)，腫瘤患者血漿和淋巴中多存在高濃度的鞘氨醇-1-磷酸[23]。模擬微重力環(huán)境下人胃黏膜上皮GES-1細胞的鞘磷脂等代謝異常，有可能影響細胞的精細功能包括腫瘤性轉(zhuǎn)化[24]。我們研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力環(huán)境下人胃黏膜上皮GES-1細胞發(fā)生SM表達下調(diào)的同時，Sphingosine和Galactosylsphingosine表達上調(diào)。據(jù)文獻報道，Sphingosine和Galactosylsphingosine定位于脂質(zhì)筏并擾亂膜的完整性，且可抑制蛋白激酶C向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運[25]。KEGG數(shù)據(jù)庫富集通路分析結(jié)果顯示，模擬微重力環(huán)境中人胃黏膜上皮GES-1細胞的差異代謝物同樣涉及腫瘤調(diào)控通路。微重力環(huán)境對腫瘤的影響，已引起學(xué)術(shù)界的重視[26]。本課題組前期進行模擬微重力對人HGC-27胃癌細胞的研究，代謝組學(xué)分析顯示，RCCS模擬微重力環(huán)境主要影響人HGC-27胃癌細胞的脂質(zhì)代謝，同時發(fā)現(xiàn)RCCS模擬微重力環(huán)境下人HGC-27胃癌細胞的增殖、細胞周期和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。顯然，微重力環(huán)境下人HGC-27胃癌細胞在代謝組學(xué)水平和超微結(jié)構(gòu)層面發(fā)生了重要變化[6-7]。故探討微重力環(huán)境下機體細胞的腫瘤性轉(zhuǎn)化特點抑或觀察微重力環(huán)境對腫瘤細胞的影響，對豐富航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論、為航天員長期駐留太空提供醫(yī)學(xué)保障均具有重要意義。