高 瑕，馮 同，李萬(wàn)成

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種臨床上常見的以中老年人群發(fā)病為主的間質(zhì)性肺疾病，發(fā)病率約為10/10萬(wàn)，病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，臨床預(yù)后差[1]。近年來(lái)，IPF發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，引起了世界各國(guó)的高度關(guān)注[2-5]。IPF的主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難加重，晚期可出現(xiàn)咳嗽、咳痰、乏力、消瘦，因缺乏有效治療藥物，5年生存率低于50%，患者最終多死于呼吸衰竭[6-7]。目前，臨床治療IPF仍以糖皮質(zhì)激素為主，但療效欠佳，且長(zhǎng)期使用存在嚴(yán)重的毒副作用[8-9]，因此應(yīng)用受限。吡非尼酮作為抗纖維化的新型藥物，可有效抑制肺功能下降、改善患者呼吸困難癥狀，但此藥物也因價(jià)格昂貴，并且具有較大的肝毒性、光毒性等不良反應(yīng)[10-11]，導(dǎo)致臨床應(yīng)用較少。因此，明確IPF的發(fā)病機(jī)制及尋找一種可有效作用于該機(jī)制靶點(diǎn)的藥物就顯得極為迫切。近來(lái)研究表明中藥類制劑甘草酸在肺纖維化防治方面起重要作用[12]。異甘草酸鎂(MgIG)是一種肝細(xì)胞保護(hù)劑，為第四代甘草酸制劑[13]，Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)在放射性肺纖維化模型中，MgIG表現(xiàn)出較好的抗纖維化作用。但目前關(guān)于MgIG對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠的治療作用報(bào)道甚少，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素來(lái)構(gòu)建肺纖維化大鼠模型，旨在研究MgIG對(duì)層黏連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及羥脯氨酸(Hyp)表達(dá)的影響，探索MgIG對(duì)肺纖維化的保護(hù)作用機(jī)制，以期為臨床防治肺纖維化找到新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只8～10周成年、雄性SPF級(jí)健康SD大鼠，體質(zhì)量(200.0±20.0)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。大鼠在通風(fēng)良好、光照適宜、溫度和濕度合適的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2主要試劑 博來(lái)霉素(成都梓誠(chéng)奕博生物科技有限公司生產(chǎn))，MgIG注射液(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn))，HE染色試劑盒(武漢Boster生物工程有限公司生產(chǎn))，Masson染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn))，LN、HA、Hyp檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))，PCⅢ檢測(cè)試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰旧a(chǎn))，TGF-β1檢測(cè)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司生產(chǎn))。

1.3主要方法

1.3.1動(dòng)物模型制備：將預(yù)先備好的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組，每組8只。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)1周后將大鼠稱重，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠的頭部及四肢用皮筋固定于操作臺(tái)上，碘伏棉球消毒大鼠頸部皮膚，在無(wú)菌操作下切開頸部皮膚1～2 cm，止血鉗逐層鈍性分離組織，充分暴露氣管。模型組及干預(yù)組大鼠用1 ml注射器穿刺向氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素溶液(5 mg/kg)，對(duì)照組大鼠于氣管內(nèi)注入等量0.9%氯化鈉注射液。注射后立即將大鼠上下、左右旋轉(zhuǎn)5 min，使藥物盡可能均勻分布于肺部。

1.3.2藥物干預(yù)：肺纖維化大鼠模型構(gòu)建成功后24 h，干預(yù)組大鼠腹腔注射MgIG注射液30 mg/(kg·d),余2組每日腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)干預(yù)28 d。

1.3.3標(biāo)本采集：大鼠血清標(biāo)本采集：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定于操作臺(tái)上，消毒、備皮，切開腹腔，取腹主動(dòng)脈近心端全血4 ml，室溫靜置2 h后置入離心機(jī)中3000 r/min離心15 min，取上清液于-80℃環(huán)境保存?zhèn)溆?，待全部血清采集完畢后按照各檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行操作。肺組織標(biāo)本采集：切開大鼠胸骨，結(jié)扎氣管，取大鼠全肺，用0.9%氯化鈉注射液清洗、濾紙擦凈肺表面多余水分后稱重，計(jì)算肺系數(shù)(肺濕質(zhì)量/肺體質(zhì)量)，并將左肺下葉組織固定于4%多聚甲醛中，放置于4℃冰箱中至少24 h后行組織脫水、石蠟包埋、切片(厚度約3 μm)，再行HE染色、Masson染色后顯微鏡下觀察。參照Szapiel等[15]方法對(duì)肺泡炎及肺纖維化程度進(jìn)行評(píng)分，無(wú)肺泡炎為0分、肺泡炎面積<20%為1分、肺泡炎面積20%～50%為2分、肺泡炎面積>50%為3分，無(wú)纖維化為0分、纖維化面積<20%為1分、纖維化面積20%～50%為2分、纖維化面積>50%為3分。取右肺下葉組織保存于-80℃冰箱用于Hyp含量測(cè)定。

1.3.4肺組織Hyp含量測(cè)定：取100 mg新鮮大鼠右肺下葉組織，加入組織裂解液1 ml，震蕩混勻，于100℃水中水解20 min；取4 ml反應(yīng)試劑，混勻(注意全程pH維持在6.0～6.8)，高溫水浴鍋中靜置20 min后取出，放置室溫中待自然冷卻后離心15 min，取上清液于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定其吸光度值，并計(jì)算Hyp含量。

2 結(jié)果

2.1大鼠肺組織大體改變 對(duì)照組：肉眼觀大鼠肺組織形態(tài)正常，表面光滑、濕潤(rùn)，呈粉紅色，彈性較好。模型組：與對(duì)照組比較，肺組織體積明顯縮小，表面凹凸不平，缺血面積大，呈暗紅色，彈性差。干預(yù)組：肺組織大體形態(tài)介于對(duì)照組及模型組之間，體積稍縮小，表面較紅潤(rùn)，局部凹凸不平、有散在出血點(diǎn)，彈性欠佳。

2.2大鼠肺組織病理學(xué)改變

2.2.1肺組織HE染色：對(duì)照組：大鼠肺組織肺泡形態(tài)、結(jié)構(gòu)均完整，肺泡間隔清晰可見，無(wú)充血、水腫，幾乎無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維滲出。模型組：肺泡壁結(jié)構(gòu)斷裂，肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡腔內(nèi)見大量炎性細(xì)胞及膠原纖維滲出。干預(yù)組：肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞，較多炎性細(xì)胞及膠原纖維滲出，但程度較模型組輕。見圖1。

圖1 3組大鼠肺組織HE染色所示(×100) 對(duì)照組為未造模大鼠組，模型組為肺纖維化大鼠組，干預(yù)組為異甘草酸鎂干預(yù)的肺纖維化大鼠組

2.2.2肺組織Masson染色：對(duì)照組：大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，有極少許藍(lán)色膠原纖維沉積。模型組：大鼠肺組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)破壞明顯，鏡下見大量藍(lán)色膠原纖維沉積。干預(yù)組：大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)部分破壞、融合，見較多膠原纖維沉積，相較模型組藍(lán)色膠原纖維面積有所減少，纖維化程度有所減輕。見圖2。

圖2 3組大鼠肺組織 Masson染色所示(×100) 對(duì)照組為未造模大鼠組，模型組為肺纖維化大鼠組，干預(yù)組為異甘草酸鎂干預(yù)的肺纖維化大鼠組

2.3大鼠肺系數(shù)、肺泡炎評(píng)分、肺纖維化評(píng)分比較 與對(duì)照組大鼠比較，模型組和干預(yù)組大鼠肺系數(shù)、肺泡炎評(píng)分、肺纖維化評(píng)分均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相較模型組大鼠，干預(yù)組大鼠上述指標(biāo)均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠肺系數(shù)、肺泡炎評(píng)分、肺纖維化評(píng)分

2.4大鼠血清肺纖維化指標(biāo)比較 與對(duì)照組大鼠比較，模型組和干預(yù)組大鼠血清LN、HA、PCⅢ含量均明顯增加(P<0.05)；相較模型組大鼠，干預(yù)組大鼠血清LN、HA、PCⅢ含量均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠血清肺纖維化指標(biāo)比較

2.5大鼠血清TGF-β1含量比較 與對(duì)照組大鼠比較，模型組和干預(yù)組大鼠血清TGF-β1含量明顯增加(P<0.05)；與模型組大鼠比較，干預(yù)組大鼠血清TGF-β1含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 3組大鼠血清TGF-β1含量比較 對(duì)照組為未造模大鼠組，模型組為肺纖維化大鼠組，干預(yù)組為異甘草酸鎂干預(yù)的肺纖維化大鼠組；TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，cP<0.05

2.6大鼠肺組織Hyp含量比較 與對(duì)照組大鼠比較，模型組和干預(yù)組大鼠肺組織Hyp含量明顯增加(P<0.05)；與模型組大鼠比較，干預(yù)組大鼠肺組織Hyp含量有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 3組大鼠肺組織Hyp含量比較 對(duì)照組為未造模大鼠組，模型組為肺纖維化大鼠組，干預(yù)組為異甘草酸鎂干預(yù)的肺纖維化大鼠組；Hyp為羥脯氨酸；與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，cP<0.05

3 討論

IPF是一種病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的疾病，主要病理改變?yōu)榉闻萸粌?nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔斷裂和肺間質(zhì)纖維化[16-18]。研究表明，氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺損傷動(dòng)物模型與人肺纖維化改變極其相似，是目前國(guó)內(nèi)外最經(jīng)典的造模方法[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)也采用氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素來(lái)誘導(dǎo)肺纖維化模型，肺組織病理結(jié)果顯示：肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡壁結(jié)構(gòu)斷裂，肺泡腔內(nèi)見大量炎性細(xì)胞滲出及大量藍(lán)色膠原纖維沉積，表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的肺纖維化大鼠模型是成功的。

MgIG是第四代甘草酸提取物，于21世紀(jì)初應(yīng)用于臨床，是單一構(gòu)型的18α-甘草酸制劑，與一代、二代、三代甘草酸提取物比較，具有腸道吸收好、療效佳、不良反應(yīng)小、安全性高、肝臟靶向性高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于肝炎和肝纖維化的治療[20]。近來(lái)研究表明，MgIG可有效減輕百草枯中毒導(dǎo)致的肺損傷及放射性肺纖維化[21-22]。

TGF-β1由淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族中的一種亞型[23]，在機(jī)體免疫、損傷修復(fù)、基質(zhì)形成等過(guò)程中起重要作用。TGF-β1是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子，其激活與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型中，TGF-β1的表達(dá)顯著升高，而進(jìn)行藥物干預(yù)后TGF-β1表達(dá)下調(diào)，且小鼠炎癥反應(yīng)及纖維化程度得到明顯改善，提示TGF-β1在肺纖維化中起著重要作用[25-26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1在模型組中水平升高，而在干預(yù)組中水平較模型組降低，提示MgIG可下調(diào)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型中TGF-β1的表達(dá)。

Hyp是膠原纖維特有的氨基酸，在肺纖維化組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，是反映肺纖維化程度的重要指標(biāo)[27]。LN是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的一種非膠原糖蛋白，由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞產(chǎn)生，與膠原一起構(gòu)成基底膜成分，其是細(xì)胞黏著于基質(zhì)的介質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。研究發(fā)現(xiàn)，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型中，LN表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，提示LN參與了肺纖維化形成過(guò)程[28]。HA是一種酸性黏多糖，主要由成纖維細(xì)胞分泌產(chǎn)生，廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一。研究表明，在間質(zhì)性肺疾病患者中HA水平升高[29]，提示HA也參與了肺纖維化的形成。PCⅢ作為Ⅲ型膠原的前體，也是組成細(xì)胞基質(zhì)的重要成分，其血清含量反映了膠原纖維合成及代謝情況[30-31]。在IPF患者血清中發(fā)現(xiàn)，PCⅢ水平較對(duì)照組顯著升高，其可作為評(píng)估肺纖維化嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型中，Hyp、LN、HA、PCⅢ水平較對(duì)照組升高，故再次證明本實(shí)驗(yàn)肺纖維化模型的構(gòu)建成功，這也為臨床診斷肺纖維化提供了可靠的指標(biāo)。

綜上，MgIG可能通過(guò)抑制TGF-β1、LN、HA、PCⅢ、Hyp水平進(jìn)而改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)大鼠肺泡炎及肺纖維化程度。