劉騰飛，安驕娜，朱 翊，張?zhí)K芮

黑色素瘤是一種侵襲性的黑色素細(xì)胞，其惡性程度較高，預(yù)后較差[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，黑色素瘤的發(fā)病率在我國正不斷上升,已成為較為嚴(yán)重的惡性腫瘤之一[2]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)的半自主性細(xì)胞器，在細(xì)胞能量代謝、活性氧生成、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[3]。線粒體具有自己的DNA，但與細(xì)胞核DNA相比，線粒體DNA(mtDNA)缺乏具有保護(hù)作用的組蛋白，且DNA修復(fù)能力較低，因此極易受到活性氧和其他類型的遺傳毒性損傷[4]。有相關(guān)研究表明，mtDNA的異常在神經(jīng)退行性疾病、線粒體肌病等眾多疾病中起關(guān)鍵作用，且與黑色素瘤密切相關(guān)[5]。黑素細(xì)胞系對活性氧的增加極為敏感，而黑素細(xì)胞依賴于有效的抗氧化措施[6]。因此，mtDNA拷貝數(shù)的變化可以通過影響抗氧化能力，從而改變黑素細(xì)胞的活性氧水平，導(dǎo)致黑素細(xì)胞癌變[7]。因此，本研究對mtDNA拷貝數(shù)在黑色素瘤術(shù)后復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)及與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系展開探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月—2020年8月安國市醫(yī)院收治的40例黑色素瘤術(shù)后復(fù)發(fā)患者為病例Ⅰ組以及48例黑色素瘤初發(fā)患者為病例Ⅱ組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～80歲；病例Ⅰ組有黑色素瘤發(fā)病史，并行標(biāo)準(zhǔn)黑色素瘤根治術(shù)；未進(jìn)行任何新輔助化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：中樞神經(jīng)性疾病患者；嚴(yán)重肝腎功能不全者；預(yù)期生存時(shí)間<6個(gè)月。病例Ⅰ組男24例，女16例；年齡37～75(52.76±16.32)歲；根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的TNM分期(第七版)[8]標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ期4例，Ⅱ期12例，Ⅲ期17例，Ⅳ期7例。病例Ⅱ組男26例，女22例；年齡35～77(53.62±17.24)歲；TNM分期為：Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期23例，Ⅳ期3例。另選同期健康受試者50例為對照組。對照組男30例，女20例；年齡27～54(37.32±8.64)歲。

1.2主要試劑 血液DNA試劑盒購自北京天根生物有限公司，大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞購自北京華越洋生物科技有限公司，pUCm-T核實(shí)載體聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物克隆試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，Takara Premix Taq (Takara，貨號：R004A)、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoRI (Takara) QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(QIAGEN)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1基因組DNA提?。核谢颊咴谛g(shù)前取外周血10 ml,手術(shù)中取切除的黑色素瘤標(biāo)本，癌組織：癌中心部位組織；癌旁組織：切緣2 cm處組織。對照組僅取外周血。所有標(biāo)本用飽和酚-氯仿-異戊醇法提取核DNA及mtDNA。使DNA全溶于TE buffer溶液(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽10 mmol/L，乙二胺四乙酸1 mmol/L，pH=8.0)，使用紫外分光光度計(jì)測量其波長到達(dá)260 nm時(shí)的吸光度值,對DNA濃度進(jìn)行計(jì)算,最后放置于-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2質(zhì)粒DNA的克隆與鑒定：PCR擴(kuò)增全長1284 bp的mtDNA的D-loop區(qū)引物，反向引物：5'-TTGAGGAGGTAAGCTACAT-3'，正向引物從15 885～15 904：5'-CCTGTCCTGTAGTATAAAC-3'。PCR反應(yīng)管中加入反向引物1 μl，正向引物1 μl，模板DNA 5 μl,Takara Premix Taq 25 μl，添雙蒸水至終體積50 μl。PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5 min； 94℃變性10 min， 53℃退火1 min， 72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)后再進(jìn)行72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pUCm-載體進(jìn)行連接后，于大腸桿菌DH10B中克隆，采用堿裂解法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行制作備用。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)品制備：使用限制性Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒和內(nèi)切酶EcoRI使其呈線形。倍比稀釋質(zhì)粒DNA,制作6個(gè)實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.4實(shí)時(shí)定量PCR：標(biāo)準(zhǔn)為包含D-loop區(qū)的pUCm-T載體,實(shí)時(shí)定量PCR(反向引物從582～599：5'-TTGAGGAGGTAAGCTACAT-3'，正向引物從483～500：5'-ATCAATACAACCCCCGCC-3'，擴(kuò)增全長117 bp)測定mtDNA。使用實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行測定，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1不同組織mtDNA拷貝數(shù)比較 病例Ⅰ組及Ⅱ組腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)均顯著高于癌旁組織，且病例Ⅰ組腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)顯著高于病例Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)病例Ⅰ組及Ⅱ組外周血mtDNA拷貝數(shù)顯著高于對照組，且病例Ⅰ組顯著高于病例Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組不同組織mtDNA拷貝數(shù)

2.2不同TNM分期腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)比較 病例Ⅰ組不同TNM分期腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)均顯著高于病例Ⅱ組，且2組中腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 病例Ⅰ組和Ⅱ組不同TNM分期腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)比較

2.3病例Ⅰ組腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 以病例Ⅰ組腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)中位數(shù)(8.38×1013copy/μg DNA)為界值分為高拷貝數(shù)組20例和低拷貝數(shù)組20例,統(tǒng)計(jì)2組拷貝數(shù)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 病例Ⅰ組腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系(例)

3 討論

惡性黑色素瘤是由于黑色素細(xì)胞異常產(chǎn)生的，其惡性程度極高且預(yù)后較差。近年來，黑色素瘤的發(fā)病率正在逐年上升，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，全球每年約有20萬新發(fā)的黑色素瘤病例出現(xiàn)[9]。線粒體功能缺陷是腫瘤發(fā)生及發(fā)展的重要原因之一[10-11]。機(jī)體能量代謝的變化及氧化磷酸化相關(guān)酶活性和mtDNA拷貝數(shù)的降低與眾多實(shí)體腫瘤具有密切關(guān)聯(lián)[12]。相較于核基因組，mtDNA缺少具有保護(hù)作用的組蛋白，且DNA修復(fù)能力較低，因此極易遭受致癌物質(zhì)的攻擊，是致癌物質(zhì)的主要攻擊靶點(diǎn)[13]。

在既往的研究中，mtDNA拷貝數(shù)與腫瘤的關(guān)系結(jié)果不一。流行病學(xué)研究表明，外周血中mtDNA拷貝數(shù)的增加與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著關(guān)聯(lián)；然而，其他研究顯示外周血中mtDNA拷貝數(shù)的增加與患結(jié)直腸癌和腎癌的風(fēng)險(xiǎn)成反比[14-15]。還有研究顯示，mtDNA拷貝數(shù)與胃癌風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性[16]。

紫外線照射可促進(jìn)黑素細(xì)胞色素的產(chǎn)生，阻斷此機(jī)制通常可保護(hù)皮膚免受紫外線A和B對DNA的有害影響。然而，活性氧是黑色素生成的天然產(chǎn)物。原代培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞中，黑色素與細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累和細(xì)胞抗氧化谷胱甘肽的減少有關(guān)[17]。抑癌蛋白p16Ink4a在黑素細(xì)胞的細(xì)胞周期控制中起著重要作用。Ink4a缺乏癥可以顯著增加痣積聚和黑色素瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。p16Ink4a可防止活性氧的積累，使活性氧與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能脫鉤。p16Ink4a缺乏癥可增加多種細(xì)胞的活性氧水平，這種作用在黑素細(xì)胞中尤為突出，且呈黑色素依賴性。因此，黑素細(xì)胞中活性氧的增加不僅可能導(dǎo)致基因組DNA中潛在致癌基因突變，而且會(huì)對mtDNA造成明顯的損傷。這種mtDNA損傷可能引起線粒體產(chǎn)生增加的代償反應(yīng)，從而保護(hù)線粒體基因組，維持正常功能。因此，在黑色素瘤中，mtDNA拷貝數(shù)的增加可以反映出細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的增加。Boulton和Birch-Machin[18]的研究報(bào)道了色素產(chǎn)生與線粒體產(chǎn)生活性氧的直接關(guān)系，提示色素產(chǎn)生、活性氧和線粒體之間存在著密切的關(guān)系。

本次研究對黑色素瘤初發(fā)及術(shù)后復(fù)發(fā)患者各組織中mtDNA拷貝數(shù)的變化進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)病例Ⅰ組和Ⅱ組患者腫瘤組織內(nèi)的mtDNA拷貝數(shù)相較于癌旁組織明顯升高。且結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤復(fù)發(fā)患者腫瘤組織中mtDNA拷貝數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系，這提示在黑色素瘤中mtDNA拷貝數(shù)的升高，可以反映出腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的升高。同時(shí)本研究結(jié)果中，病例Ⅰ組及Ⅱ組患者外周血mtDNA拷貝數(shù)相較于健康受試者明顯升高，這說明mtDNA拷貝數(shù)在黑色素瘤中具有較高的特異性及敏感性。

綜上所述，mtDNA可以當(dāng)作黑色素瘤篩查和術(shù)后監(jiān)測的關(guān)鍵指標(biāo)，為黑色素瘤的檢測及預(yù)警提供了新的思路。