吳 偉 苗向碩 吳曉娟

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，長沙 410004)

米糠是稻谷加工產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物之一，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)12%～20%，是一種豐富而價(jià)廉的植物蛋白資源[1]。米糠蛋白(Rice bran protein，RBP)具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和生理活性，還具有良好的溶解性和乳化性，可作為食品配料或添加劑應(yīng)用于飲料、醬料、肉制品等多種食品[2]。相比于化學(xué)合成的表面活性劑，基于蛋白質(zhì)的乳化體系對(duì)pH值、離子強(qiáng)度等十分敏感，容易發(fā)生液滴聚集、脂質(zhì)氧化等不良反應(yīng)，極大地限制了RBP作為天然乳化劑在食品中的應(yīng)用。天然多酚化合物可以延緩蛋白質(zhì)乳液的脂質(zhì)氧化，對(duì)于穩(wěn)定食品乳化體系具有重要作用[3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是綠茶中最主要的活性多酚，具有很強(qiáng)的清除自由基和抑制脂質(zhì)氧化的能力[4]。適量的EGCG可與RBP通過氫鍵、范德華力、疏水作用力等形成穩(wěn)定的復(fù)合體系，提高RBP的持水性、乳化性、起泡性等[4-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EGCG與蛋白質(zhì)的相互作用不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，還會(huì)影響其體外胃蛋白酶消化性質(zhì)。Cao等[7]發(fā)現(xiàn)EGCG的添加可提高乳清蛋白的體外胃蛋白酶消化性。Stojadinovic等[8]發(fā)現(xiàn)富含EGCG的茶多酚會(huì)抑制β-乳球蛋白的體外胃蛋白酶消化性。Zhou等[9]發(fā)現(xiàn)共價(jià)交聯(lián)EGCG-大豆分離蛋白復(fù)合物的體外胃蛋白酶消化率隨著EGCG添加量的增加而上升，而EGCG-大豆分離蛋白非共價(jià)復(fù)合物的體外胃蛋白酶消化率則會(huì)隨著EGCG添加量的增加而下降。另外，EGCG還會(huì)使蛋白消化產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的抗氧化性，這一指標(biāo)是評(píng)價(jià)多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物作為食品添加劑和生物活性成分的重要依據(jù)[9]。鑒于EGCG對(duì)于不同蛋白質(zhì)消化性質(zhì)的影響差異較大，且目前鮮有關(guān)于EGCG影響RBP消化性質(zhì)的研究報(bào)道，本研究擬采用體外模擬胃消化實(shí)驗(yàn)分析EGCG-RBP復(fù)合體系的消化進(jìn)程以及消化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征和抗氧化性，為RBP及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠、EGCG(純度≥98%)、胃蛋白酶(900 U/mg)、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品(12～80 ku)、肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LYNX 6000高速冷凍離心機(jī)，K9840自動(dòng)凱氏定氮儀，F(xiàn)D5-4冷凍干燥機(jī)，Healthcare SE260電泳儀，LC-20高效液相色譜儀，TSKgel SW G2000 SWXL色譜柱，BlueStar紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 RBP制備

參考苗向碩等[6]的方法，將脫脂米糠和去離子水以1∶10(g∶mL)混合，用2 mol/L NaOH調(diào)pH值至9.0，在40℃下磁力攪拌提取4 h，隨后在4 ℃、8 000 g離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl調(diào)pH至4.0，靜置20 min后在4 ℃、8 000 g離心20 min得到蛋白質(zhì)沉淀，水洗沉淀3次后將沉淀分散于5倍體積的去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.0，透析24 h脫鹽，最后冷凍干燥得到RBP。

1.3.2 EGCG-RBP復(fù)合物制備

參考Yang等[4]的方法，將RBP加入0.02 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，配制成50 mg/mL的蛋白溶液，并將EGCG按一定質(zhì)量比加入RBP溶液中，使EGCG與RBP質(zhì)量比分別為0∶1、0.02∶1、0.2∶1、0.5∶1，在室溫下混合磁力攪拌2 h形成EGCG-RBP復(fù)合體系。將反應(yīng)后的樣品透析48 h去除未結(jié)合的EGCG，透析后將EGCG-RBP復(fù)合物冷凍干燥，于4 ℃避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 體外模擬胃消化

參考江連洲等[10]方法，將50 mL EGCG-RBP復(fù)合物樣品(濃度以蛋白計(jì)，50 mg/mL)和32 mL模擬胃環(huán)境的電解質(zhì)溶液混合，再準(zhǔn)確量取一定體積2 mol/L HCl調(diào)pH 2.0，再加入(9.975-VHCl) mL蒸餾水，隨后加入由電解質(zhì)溶液配制的8 mL胃蛋白酶(25 000 U/mL)，最后加入25 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液。將混合液置于37 ℃恒溫振蕩水浴器中消化反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后用2 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0終止消化。消化液在4 ℃、10 000 g離心20 min去除沉淀，將上清液冷凍干燥后于4 ℃避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 EGCG對(duì)RBP胃蛋白酶消化進(jìn)程的影響

參考Chen等[11]方法，分別在胃蛋白酶酶解0、5、10、20、30、40、60、90 min時(shí)加入2 mol/L HCl調(diào)pH至7.0終止消化，加入等體積 20% 三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)混合，在4 ℃下反應(yīng)30 min，然后在4 ℃、10 000 g離心10 min去除蛋白沉淀，采用凱氏定氮法分別測定上清液中氮含量N1和EGCG-RBP復(fù)合物總氮含量N0。EGCG-RBP的消化程度用TCA溶解肽得率Y表示，計(jì)算公式為：

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參照苗向碩等[6]方法，分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是12.5%和4%，消化產(chǎn)物樣品濃度3 mg/mL(以蛋白計(jì))，上樣量12 μL。初始電流為10 mA，待樣品達(dá)到分離膠后改為25 mA。

1.3.6 消化產(chǎn)物肽分子質(zhì)量分布的測定

參考Chen等[11]的方法，用流動(dòng)相將肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品配制成1 mg/mL的溶液，過孔徑0.22 μm的醋酸纖維素膜。用高效液相色譜儀對(duì)樣品進(jìn)行分析，色譜柱是TSKgel SW G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm，5 μm)，柱溫設(shè)定為25 ℃；二級(jí)陣列檢測器，檢測波長設(shè)定為220 nm；流動(dòng)相是0.1 mol/L、pH 6.8含0.1 mol/L Na2SO4的磷酸鹽緩沖液，流速0.5 mL/min。測定結(jié)束后，以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間作標(biāo)準(zhǔn)曲線：logMw=-0.237T+7.158(R2=0.99)。

1.3.7 消化產(chǎn)物抗氧化性的測定

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行測定3 次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，并使用Origin 7.5軟件采用最小顯著差異法進(jìn)行指標(biāo)比較，取95%置信度(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)RBP體外胃蛋白酶消化進(jìn)程的影響

當(dāng)EGCG∶RBP在0.02∶1～0.5∶1之間時(shí)，EGCG對(duì)RBP的功能性質(zhì)有很好的提升作用，并且RBP也可以作為EGCG在胃腸消化過程中的優(yōu)良遞送載體，因而以未添加EGCG的RBP為對(duì)照，研究質(zhì)量比為0.02∶1～0.5∶1的EGCG-RBP復(fù)合物的體外胃蛋白酶消化進(jìn)程[6, 13]。如圖1所示，隨著消化時(shí)間的延長，EGCG-RBP復(fù)合物逐漸被胃蛋白酶水解，TCA溶解肽得率隨之增加。隨著EGCG添加量的增加，TCA溶解肽得率逐漸降低。RBP體外胃蛋白酶消化進(jìn)程曲線與大豆蛋白、肉蛋白等其他來源蛋白質(zhì)的極其相似[10, 14]。為了更好地表征EGGC對(duì)RBP消化進(jìn)程的影響，參考Bax等[14]的方法，引入擬合指數(shù)曲線方程：

1/Y=1/Ymax×eβ(1/t)

式中：Ymax為消化完全時(shí)的最大Y值；β為曲線形狀系數(shù)。

圖1 不同添加量EGCG對(duì)RBP體外胃蛋白酶消化進(jìn)程的影響

同時(shí)引入半衰期t1/2表示達(dá)到0.5倍Ymax所需的消化時(shí)間，計(jì)算公式為t1/2=β/ln2，再根據(jù)半衰期對(duì)應(yīng)的Y值計(jì)算初始消化速率ΔY/min。結(jié)果如表1所示，隨著EGCG添加量的增加，RBP的初始消化速率迅速減小，并伴隨著Ymax下降和半衰期延長，表明EGCG抑制了RBP的體外胃蛋白酶消化性。已有研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可誘導(dǎo)RBP通過疏水相互作用產(chǎn)生不溶性聚集體，EGCG酚羥基還可與RBP清蛋白主肽鏈的酰胺羰基之間產(chǎn)生氫鍵和范德華力，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)締合[4, 6]。這些非共價(jià)作用力誘導(dǎo)產(chǎn)生的聚集體可能會(huì)掩蔽RBP的胃蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)，成為抑制RBP體外胃蛋白酶消化性的主要原因[10]。另外，消化過程中隨著RBP空間結(jié)構(gòu)的破壞，與RBP結(jié)合的EGCG會(huì)逐漸釋放到消化液中，游離的EGCG可通過親水或疏水相互作用與胃蛋白酶結(jié)合，導(dǎo)致胃蛋白酶活性降低[15]。

表1 不同添加量EGCG的RBP體外胃蛋白酶消化進(jìn)程擬合曲線參數(shù)

2.2 EGCG對(duì)RBP消化產(chǎn)物亞基結(jié)構(gòu)的影響

SDS-凝膠電泳圖(圖2)反映了消化過程中EGCG-RBP復(fù)合物亞基結(jié)構(gòu)的變化。未消化的RBP亞基結(jié)構(gòu)如泳道2所示，小于12 ku的條帶主要是醇溶蛋白亞基，20 ku和40 ku分別是谷蛋白堿性亞基和酸性亞基，25 ku、50 ku和60 ku是球蛋白和清蛋白的亞基[16, 17]。隨著消化時(shí)間延長，未添加EGCG的RBP清蛋白亞基、球蛋白亞基和谷蛋白酸性亞基很快被胃蛋白酶消化，隨后谷蛋白堿性亞基也逐漸被消化，但直到消化結(jié)束，仍有部分醇溶蛋白亞基未被降解(圖2a)。江連洲等[18]關(guān)于大豆蛋白體外模擬消化研究也發(fā)現(xiàn)，酸性亞基比堿性亞基容易降解，親水性亞基比疏水性亞基容易降解。相比未添加EGCG的樣品，添加了EGCG的RBP在分離膠頂部產(chǎn)生了較深的聚集體條帶。這一方面可能是由于EGCG酚羥基容易氧化形成醌，進(jìn)而與色氨酸殘基、賴氨酸殘基、半胱氨酸巰基等親核試劑發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)；另一方面，酚酸在中性條件下會(huì)誘導(dǎo)游離巰基去質(zhì)轉(zhuǎn)化，形成硫醇離子與羰基反應(yīng)[7]。前期關(guān)于EGCG影響RBP結(jié)構(gòu)特征的研究也證實(shí)，EGCG會(huì)使得RBP的總巰基含量下降，形成二硫鍵或非二硫鍵共價(jià)交聯(lián)的聚集體[6]。當(dāng)EGCG∶RBP達(dá)到0.2∶1和0.5∶1時(shí)，EGCG還會(huì)明顯抑制RBP清蛋白亞基、球蛋白亞基和谷蛋白酸性亞基消化降解(圖2c和圖2d)，這可能與RBP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)，酚類化合物可通過氫鍵和靜電作用力與α-螺旋、β-折疊等有序結(jié)構(gòu)相結(jié)合，抑制有序結(jié)構(gòu)被消化降解[8, 10]。

注：a～d：EGCG∶RBP分別為0∶1、0.02∶1、0.2∶1、0.5∶1；泳道1～9分別對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白、米糠蛋白以及胃蛋白酶酶解5、10、20、30、40、60和90 min的消化產(chǎn)物。圖2 不同添加量EGCG對(duì)RBP體外胃蛋白酶消化產(chǎn)物亞基結(jié)構(gòu)的影響

2.3 EGCG對(duì)RBP消化產(chǎn)物肽分子質(zhì)量分布的影響

EGCG對(duì)RBP消化產(chǎn)物肽分子質(zhì)量分布的影響如表2所示。消化90 min時(shí)，未添加EGCG的RBP胃蛋白酶水解肽89%以上都分布在0～800 u。不論是消化率還是低分子質(zhì)量肽的含量，RBP都呈現(xiàn)出優(yōu)于大豆蛋白的消化性，與肉蛋白、酪蛋白等相當(dāng)[14, 18, 19]。隨著EGCG添加量的增加，分子質(zhì)量小于800 u的肽所占比例逐漸下降，分子質(zhì)量大于800 u的肽所占比例逐漸增加，尤其是分子質(zhì)量在800～3 000 u的肽含量顯著(P<0.05)增加，表明EGCG可顯著抑制RBP的體外胃蛋白酶消化性。

表2 不同添加量EGCG對(duì)RBP體外胃蛋白酶水解肽分子質(zhì)量分布的影響

2.4 EGCG對(duì)RBP消化產(chǎn)物抗氧化性的影響

表3 不同添加量EGCG對(duì)米糠蛋白體外胃消化產(chǎn)物抗氧化性的影響

3 結(jié)論

通過體外模擬消化實(shí)驗(yàn)研究了EGCG對(duì)RBP體外胃蛋白酶消化性質(zhì)及消化產(chǎn)物抗氧化性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG會(huì)抑制RBP的體外胃蛋白酶消化率，這可能是由于EGCG與RBP之間通過非共價(jià)作用(氫鍵、范德華力、疏水作用力)和共價(jià)鍵(二硫鍵、非二硫鍵)形成聚集體，掩蔽了RBP中部分胃蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致RBP的消化性下降。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RBP中清蛋白、球蛋白、谷蛋白酸性亞基比醇溶蛋白、谷蛋白堿性亞基容易被胃蛋白酶消化，但EGCG會(huì)抑制胃蛋白酶對(duì)清蛋白、球蛋白和谷蛋白酸性亞基的降解作用，進(jìn)而使得消化產(chǎn)物中800～3 000 u的抗氧化肽段比例增加，同時(shí)RBP消化產(chǎn)物的自由基清除能力和金屬螯合能力均上升。本研究通過系統(tǒng)分析多酚-蛋白復(fù)雜體系下的RBP消化性質(zhì)，可為RBP營養(yǎng)特性評(píng)價(jià)及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供參考。但體外模擬消化環(huán)境與真實(shí)消化系統(tǒng)存在較大差異，因而在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中有必要開展體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)更深入地研究多酚-蛋白復(fù)雜體系下RBP營養(yǎng)特性的變化情況。