桂 林,卞紅磊,于溯洋,程敏靜,梁春慧

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院：1.肛腸一科；2.藥劑科，石家莊 050051)

Afadin是近期發(fā)現(xiàn)的一種黏附連接蛋白，在細(xì)胞內(nèi)與連接素(Nectins)、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白 (E-cadherin)及纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)等構(gòu)成黏附連接，參與調(diào)控細(xì)胞定向移動(dòng)、增殖等多種功能[1-3]。與此同時(shí)，多種腫瘤中存在Afadin編碼基因的異常融合，在某些類型的腫瘤，例如乳腺癌[4]、子宮內(nèi)膜癌[5]及胰腺癌[6]中，還存在Afadin表達(dá)水平的改變，本研究將檢測Afadin在結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)中的表達(dá)情況，結(jié)合臨床資料分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究已經(jīng)通過本院臨床研究倫理學(xué)會(huì)委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：H2016-008-1)。所有患者均在本院肛腸一科手術(shù)，術(shù)前都未接受新輔助治療。第一組病例包含2017年1-12月20例CRC患者，分別留取腫瘤組織及相對(duì)應(yīng)的非腫瘤組織，進(jìn)行蛋白免疫印記(Western blot)和免疫組織化學(xué)染色檢測；第二組病例包含2010年1月至2013年1月共118例CRC患者，每例患者均擁有較為完整的病例資料和隨訪信息，腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評(píng)分，并與臨床病理資料和預(yù)后資料進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2 方法

1.2.1主要試劑

兔抗人Afadin多克隆抗體購于美國Abcam公司，SP試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2.2Western blot

提取總蛋白，采取BCA法進(jìn)行蛋白定量，每組上樣20 μg，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜，一抗孵育過夜，二抗孵育1.5 h，ECL顯影，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算Afadin的表達(dá)水平。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定

切片脫蠟入水，熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加一抗后4 ℃孵育12 h，此后依次滴加二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，DAB顯色，復(fù)染后脫水透明封片。由兩位病理科醫(yī)師單獨(dú)進(jìn)行結(jié)果評(píng)分。密度評(píng)分分為：0分(陰性，無黃色)，1分(弱陽性，呈淺黃色)，2分(中等陽性，呈棕黃色)，3分(強(qiáng)陽性，呈棕色)，陽性細(xì)胞比例評(píng)分分為：0分(未見陽性細(xì)胞)，1分(陽性細(xì)胞百分比小于25%)，2分(陽性細(xì)胞百分比25%～50%)，3分(陽性細(xì)胞百分比大于50%)，兩個(gè)評(píng)分相乘即獲得免疫組織化學(xué)染色評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Afadin在CRC組織中的表達(dá)

利用Western blot對(duì)20例CRC患者的腫瘤組織及相對(duì)應(yīng)非腫瘤組織進(jìn)行Afadin表達(dá)水平檢測，其中的15對(duì)標(biāo)本(75%)，腫瘤組織中的Afadin表達(dá)水平低于相對(duì)應(yīng)的非腫瘤組織(P<0.05)，見圖 1。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，Afadin陽性細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著色。在非腫瘤組織中，Afadin呈中或強(qiáng)陽性表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色評(píng)分大于4分)的比例為70.0%(14/20)，而在腫瘤組織中，Afadin呈中或強(qiáng)陽性表達(dá)的比例為30.0%(6/20)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

A:Western blot檢測結(jié)果;B:兩組標(biāo)本表達(dá)平均灰度值比較;T:腫瘤組織；N：非腫瘤組織；1、2、3、4為病例號(hào)。

A:Afadin在腫瘤組織中低表達(dá)(×200)；B：Afadin在非腫瘤組織中高表達(dá)(×200)；C:兩組間免疫組織化學(xué)染色評(píng)分比較。

2.2 CRC組織中Afadin表達(dá)水平與臨床病理學(xué)因素之間的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步分析CRC組織中Afadin表達(dá)水平與臨床病理因素之間的相關(guān)性，筆者利用免疫組織化學(xué)染色的方法對(duì)118例CRC患者的腫瘤組織切片進(jìn)行Afadin表達(dá)水平檢測，根據(jù)免疫組織化學(xué)染色評(píng)分將其分為兩組，Afadin高表達(dá)組(IHC評(píng)分大于4分)及Afadin低表達(dá)組(IHC 評(píng)分小于或等于4分)，然后與患者的臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性研究，單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤組織中的Afadin表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理組織學(xué)類型、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，但是在浸潤深度達(dá)到T3水平及以上(P=0.020)或出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.043)的腫瘤組織中，Afadin低表達(dá)的發(fā)生率明顯升高，見表1。

表1 118例CRC患者組織標(biāo)本Afadin表達(dá)水平和臨床病理因素之間的關(guān)系

2.3 CRC組織中Afadin表達(dá)水平對(duì)預(yù)后的影響

在上述118例CRC患者中，筆者還進(jìn)行了Afadin表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，腫瘤組織中Afadin低表達(dá)患者總的生存率更低(P<0.01)，見圖3。將年齡、性別及Afadin表達(dá)水平引入Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Afadin低表達(dá)是CRC預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，見表2。

圖3 Afadin高表達(dá)組和低表達(dá)組CRC患者的生存曲線

表2 118例CRC患者預(yù)后的Cox多因素回歸分析

3 討 論

細(xì)胞極性的建立對(duì)于維持上皮細(xì)胞的屏障功能是至關(guān)重要的，細(xì)胞極性喪失不僅會(huì)導(dǎo)致上皮出現(xiàn)滲漏，還在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，目前，細(xì)胞極性喪失已經(jīng)被看作是進(jìn)展期上皮性腫瘤的標(biāo)志之一[7-8]。細(xì)胞極性的建立是一個(gè)多步驟過程，其中之一就是細(xì)胞黏附和連接復(fù)合體的正確組合，細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附主要依靠黏附連接(AJs)及緊密連接(TJs)維持。構(gòu)成黏附連接的幾種成分，例如E-cadherin 和 Catenins，與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，目前已經(jīng)成為腫瘤研究領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)[9]。Afadin作為黏附連接蛋白之一，幾乎存在于所有的上皮細(xì)胞之中，它捆綁肌動(dòng)蛋白微絲和Nectins構(gòu)成肌動(dòng)蛋白骨架，參與調(diào)控多種細(xì)胞功能。鑒于Afadin在維持細(xì)胞極性中的關(guān)鍵性作用，它也逐漸受到腫瘤研究領(lǐng)域的關(guān)注，逐漸增多的研究結(jié)果顯示，在多種類型的腫瘤中，存在Afadin表達(dá)水平的改變，并與腫瘤的惡性表現(xiàn)密切相關(guān)，例如Afadin與Claudin-2協(xié)作，共同促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[10]；在三陰乳腺癌對(duì)阿霉素耐藥的產(chǎn)生機(jī)制中，也有Afadin的參與[11]；對(duì)于惡性膠質(zhì)瘤來說，Afadin促進(jìn)了病理性血管形成[12]；當(dāng)胃癌細(xì)胞感染幽門螺桿菌后，Afadin的表達(dá)水平下降，同時(shí)伴有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]；緊密連接蛋白2通過下調(diào)Afadin/ERK信號(hào)通路，抑制骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]，這些研究都提示，Afadin可能通過多個(gè)途徑，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

根據(jù)上述研究結(jié)果，筆者推測，在CRC中可能也存在Afadin表達(dá)水平的改變，為了驗(yàn)證這種推測，本研究首先選擇了20例CRC患者的腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)的非腫瘤組織，分別利用Western blot及免疫組織化學(xué)染色的方法對(duì)Afadin蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，兩種檢測的結(jié)果都顯示，與對(duì)應(yīng)的非腫瘤組織比較，CRC組織中確實(shí)存在Afadin表達(dá)水平下降的現(xiàn)象。隨后，為了檢驗(yàn)Afadin的表達(dá)水平是否能夠反映腫瘤的惡性程度，本研究又選擇了擁有完整病例資料和隨訪信息的118例CRC患者，分別對(duì)腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評(píng)分并與臨床病理因素和預(yù)后資料進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，腫瘤組織中 Afadin的表達(dá)水平與腫瘤的浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況密切相關(guān)，與Afadin高表達(dá)的患者比較，Afadin低表達(dá)的患者總生存率明顯降低，Afadin低表達(dá)是CRC預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，這些結(jié)果提示，Afadin參與CRC的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，CRC出現(xiàn)Afadin表達(dá)水平降低，預(yù)后不良。

盡管本研究發(fā)現(xiàn)，在CRC中存在Afadin表達(dá)水平的改變，但是這種改變是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯還是翻譯后加工及修飾層面并不明確，筆者將繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究；與此同時(shí)，筆者還將對(duì)CRC細(xì)胞的Afadin表達(dá)水平進(jìn)行干預(yù)，觀察干預(yù)后CRC細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，以進(jìn)一步明確Afadin與CRC的相關(guān)性，為探索Afadin是否能夠成為治療CRC的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。