宋 瑤,姜永紅,姜之炎,趙曉陽,肖 臻

(上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

肺炎支原體是介于細菌和病毒之間的最小病原微生物，能夠在無細胞培養(yǎng)基上獨立存活，是能夠引發(fā)呼吸道感染的常見病原體。肺炎支原體可通過飛沫傳播，進入人體后可有2～3周的潛伏期，繼而呈現(xiàn)相關的臨床癥狀，嚴重者會發(fā)展為肺炎支原體肺炎，也會有大約1/3的人成為無癥狀的肺炎支原體攜帶者。肺炎支原體肺炎患者臨床表現(xiàn)主要以發(fā)熱、咳嗽為主，也有畏寒、頭痛、遍體不適等癥，病程在1～3周。支原體肺炎好發(fā)于3歲以上兒童及青年人，有地區(qū)流行的特點。目前關于肺炎支原體肺炎致病的具體機制仍不十分明確，主要包括呼吸道上皮黏附[1-2]、肺炎支原體直接侵犯細胞及免疫功能紊亂[3]等，氧化應激引起的肺損傷與肺炎支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展有重要關系[4]。近年來，隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性報道逐漸增多[5],尋找新型治療藥物迫在眉睫。項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥清肺通絡方能夠通過調(diào)控 NLRP3炎癥小體，改善免疫炎癥反應，并抑制細胞凋亡[6]。本研究以氧化應激反應為切入點，通過構(gòu)建肺炎支原體肺炎小鼠模型，探討在氧化應激和炎性反應的途徑中，中藥清肺通絡方治療肺炎支原體肺炎的作用，從中藥中找尋治療肺炎支原體肺炎的新思路和方法。

1 實驗材料與方法

1.1動物 BALB/c小鼠100只，3周齡，體重(18±2)g。由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2013-0016，合格證編號：20130016010285，檢疫后備用。SPF級動物房，雄性分籠飼養(yǎng)，空白組與感染組隔離飼養(yǎng)，自由攝取標準顆粒飼料和水，適應3 d后開始實驗。

1.2藥品 阿奇霉素干混懸劑(輝瑞制藥有限公司，國藥準字J20050062)；清肺通絡方采用中藥免煎顆粒劑(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司)，購自上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，方藥組成：桑白皮9 g、地骨皮9 g、桃仁9 g、矮地茶9 g、杏仁9 g、紫蘇子9 g、葶藶子9 g、甘草3 g。小鼠用藥劑量換算采用Bios氏公式，將100 mg阿奇霉素溶于10 mL蒸餾水，小鼠用量為0.25 mL/20 g；清肺通絡方每包中藥需水體積27.6 mL，小鼠用量0.25 mg/20 g。

1.3主要試劑 肺炎支原體國際標準株 FH(美國 ATCC 公司提供，產(chǎn)品號： ATCC15531)；一氧化氮合酶(NOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；肺炎支原體核酸檢測試劑盒(Cat.#DA-D064，達安基因)。

1.4實驗方法 將100只小鼠隨機分為正常組、模型組、清肺通絡方組、阿奇霉素組、中西醫(yī)結(jié)合組，每組20只。正常組給予 0.9%氯化鈉50 μL/次早晚滴鼻，其余組給予支原體國際標準株(將存儲在-80 ℃冰箱中混于等體積20%甘油凍存的肺炎支原體離心，分離甘油，加入無菌水后反復吹打，作為工作菌液備用)50 μL/次(含1×107ccu/mL)早晚緩慢滴入鼻腔使其進入氣管支氣管，其中前1～3 d滴鼻造模，后8～10 d再次滴鼻造模。造模第1天開始，正常組和模型組給予生理鹽水0.25 mL/20 g連續(xù)灌胃10d；清肺通絡方組給予清肺通絡方0.25 mL/20 g連續(xù)灌胃10d；阿奇霉素組給予阿奇霉素藥液0.25 mL/20 g灌胃，第1～3天和第8～10天；中西醫(yī)結(jié)合組給予阿奇霉素藥液0.25 mL/20 g灌胃，第1～3天和第8～10天，同時給予清肺通絡方0.25 mL/20 g連續(xù)灌胃10 d。

1.5檢測指標及方法 實驗第6天、第11天每組每次各處死小鼠10只，摘眼球取血，8 000 r/min離心，取上清備測；灌洗左肺，回收灌洗液；取右側(cè)肺組織3 mm×3 mm×3 mm，余置于10%福爾馬林中保存。

1.5.1肺組織切片病理觀察 小鼠肺組織樣本包埋與固定后，常規(guī)HE染色，封固保存，用顯微鏡拍照并采集分析樣本相關部位。

1.5.2肺組織中肺炎支原體DNA含量PCR法檢測 陰性質(zhì)控制品制備，取樣本勻漿至完全裂解離心，加入提取液混勻，取2 μL樣品裂解后的上清液離心；將肺炎支原體陽性定量的參考品離心；具體PCR擴增步驟按照ABI 7300擴增儀的標準操作程序進行。數(shù)據(jù)分析采用ABI Prism 7300 SDS Software。

1.5.3氧化應激指標檢測 生化法檢測小鼠肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA、SOD表達水平，檢測步驟和計算方法按照檢測試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠肺組織病理表現(xiàn) 正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯病變，見圖1；模型組小鼠支氣管黏膜細胞壞死脫落管腔變窄，肺泡壁和間隔有大量炎性細胞浸潤，微血管擴張充盈，肺泡壁變厚破壞，見圖2；清肺通絡方組小鼠支氣管管腔變窄較為明顯，肺泡壁和間隔有炎性細胞浸潤，微血管擴張充盈較為明顯，部分肺泡壁變厚明顯，見圖3；阿奇霉素組小鼠支氣管腔變窄較不明顯，肺泡壁和間隔有較多炎性細胞浸潤，微血管中度擴張充盈，部分肺泡壁變厚，見圖4；中西醫(yī)結(jié)合組小鼠支氣管管腔變窄不明顯，肺泡壁和間隔有少量炎性細胞浸潤，微血管輕度擴張充盈，肺泡壁變厚不明顯，見圖5。

2.2各組小鼠肺組織中肺炎支原體DNA含量 實驗第6天和第11天，正常組小鼠肺組織中肺炎支原體DNA含量均為0，模型組均顯著增高(P均<0.05)，清肺通絡方組、阿奇霉素組和中西醫(yī)結(jié)合組均明顯低于同期模型組(P均<0.05)，且中西醫(yī)結(jié)合組明顯低于同期清肺通絡方組和阿奇霉素組(P均<0.05)；實驗第11天與實驗第6天比較，中西醫(yī)結(jié)合組小鼠肺組織中肺炎支原體DNA含量明顯降低(P<0.05)，其他組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺組織中肺炎支原體DNA含量比較

2.3各組小鼠氧化應激指標表達水平 實驗第6天和第11天，與正常組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表達水平均明顯增高(P均<0.05)，SOD表達水平均明顯降低(P均<0.05)。與模型組比較，清肺通絡方組、阿奇霉素組和中西醫(yī)結(jié)合組NOS、iNOS、NO、MDA表達水平均明顯降低(P均<0.05)，SOD表達水平均明顯增高(P均<0.05)。 實驗第6天，阿奇霉素組肺泡灌洗液中NOS、NO、SOD表達水平，肺組織中iNOS、NO、MDA表達水平，血清中NOS、MDA表達水平改善情況均明顯優(yōu)于清肺通絡方組(P均<0.05)；中西醫(yī)結(jié)合組肺泡灌洗液中NOS、iNOS、NO表達水平，肺組織中iNOS表達水平，血清中NO、MDA表達水平均明顯低于清肺通絡方組和阿奇霉素組(P均<0.05)，肺泡灌洗液中MDA表達水平，肺組織中NO、MDA表達水平，血清中NOS、iNOS表達水平均明顯低于清肺通絡方組(P均<0.05)，而各樣本中SOD表達水平均明顯高于清肺通絡方組和阿奇霉素組(P均<0.05)。實驗第11天，阿奇霉素組與清肺通絡方組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，中西醫(yī)結(jié)合組肺泡灌洗液、肺組織中SOD表達水平均明顯高于清肺通絡方組(P均<0.05)。見圖6～8。

3 討 論

肺炎支原體能夠附著在細胞膜上，將微管插入細胞同時釋放過氧化氫和超氧游離基，中性粒細胞和其他細胞可以在炎癥反應過程中激活NOS、iNOS，并產(chǎn)生過量的NO，所以氧化應激引起的肺損傷與肺炎支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展有重要關系[7]。研究表明，肺炎支原體肺炎患者外周血單核細胞存在氧化應激反應，當機體遭受外來致病因素侵襲時，中性粒細胞作為機體最主要的活性氧(ROS)來源，其活化產(chǎn)生大量ROS，而SOD廣泛參與到急性炎癥反應中，含量大幅度降低，當ROS產(chǎn)生多于體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的抗氧化儲備時，氧自由基對肺組織的影響大大增加[8-9]。氧化應激是機體受到各種刺激后體內(nèi)的氧化與抗氧化作用失去平衡，產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物堆積，致機體損傷的一種病理過程，其中由線粒體產(chǎn)生的ROS在氧化應激中發(fā)揮著重要作用[10-11]。氧化應激反應釋放過量產(chǎn)生的ROS與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA結(jié)合發(fā)生過氧化反應，通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死，最終引起組織結(jié)構(gòu)與功能的破壞[12-13]。生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應，氧化終產(chǎn)物為MDA，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性。另外氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細胞損傷[14]。故ROS、MDA、SOD是評價氧化-抗氧化系統(tǒng)的重要指標，其中MDA為評估機體氧化損傷程度的重要依據(jù)，SOD可評價機體的抗氧化能力[15]。

肺炎支原體肺炎目前主要采用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物治療，方法較為單一且因其耐藥性的產(chǎn)生，在很大程度上較為局限。中藥及復方有望發(fā)揮多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次的作用，對治療肺炎支原體肺炎具有潛在優(yōu)勢。中醫(yī)學將肺炎支原體肺炎歸屬于“肺炎喘嗽”“咳嗽”“咳逆”“風溫”等證的范疇。錢乙《小兒要證直絕·變蒸》有云：“五臟六腑，成而未全……全而未壯?！鼻宕鷧蔷贤ㄌ岢?“小兒稚陽未充，稚陰未長者也?！睆年庩枌W說出發(fā)，陰是指體內(nèi)精、血、津液、臟腑、血脈、腦髓、筋骨、肌膚等有形之質(zhì)，陽是指體內(nèi)臟腑的生理功能的活動，吳鞠通認為小兒時期臟腑嬌嫩，行氣未充，衛(wèi)外不固，易感外邪。對于肺炎，在葉天士提出“溫邪上受，首先犯肺”，將其稱為風溫之后，才歸入到溫病范疇之中。《臨證指南醫(yī)案·溫熱》有云：“吸入溫邪，鼻通肺絡?！北菫榉沃[，指出溫邪可通過鼻竅直侵于肺絡，再通過肺絡進行傳變[16]。肺炎支原體肺炎在于外邪入肺，郁而化熱，從而使氣機升降受阻，肺絡壅滯，清肅之能受損，邪熱熏蒸，從而出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳痰、氣促等[16]。本病的基本病機為多種因素導致的“肺絡”狹窄，即肺絡閉阻、肺失宣肅，具體表現(xiàn)為初因毒邪入肺，瘀而化熱，肺氣阻滯，氣不能運血，血行滯澀，而脈絡失養(yǎng)；痰瘀壅阻肺絡，導致絡虛不榮，虛實夾雜，病情遷延難愈或易反復發(fā)作[17]。從病機出發(fā)，清肺通絡成為本病的治療關鍵。中醫(yī)治療的根本目的在于調(diào)整陰陽，使肺絡恢復通暢。治療上，葉天士提出“絡以通為用”和“凡病宜通”的思想，通絡之法強調(diào)“絡以辛為泄”，包括辛溫通絡、辛苦通絡、辛香通絡、辛咸通絡、辛潤通絡及蟲類通絡[18]。對小兒支原體肺炎治法包括祛風、解表、散寒、宣肺、活血、化瘀、清肺、化痰通絡等，應根據(jù)不同致病因素選用不同治法，但歸其目的都是為了疏通絡脈，熱者清之，痰者滌而暢之，痰瘀互阻化而通之，脈絡不足、氣陰兩虛補而和之[19-20]。

清肺通絡方是在兒科經(jīng)典名方“瀉白散”合“蘇葶丸”的基礎上，以“肺絡”理論為指導，結(jié)合臨床實踐組方而成，該方秉承以清肺為基礎同時化痰祛瘀通絡的理念，從恢復肺絡氣血供給及運行來改善支原體外邪所致的肺絡痹阻，維持正常肺的通氣與宣降功能。方中桑白皮為君藥、地骨皮為臣藥，兩者清熱瀉肺而宣通肺氣，肺之“氣絡”得通，使肺氣宣降得利，又治肺之虛熱，質(zhì)潤不燥，瀉肺而不傷肺，對小兒體質(zhì)尤為適用；杏仁宣肺平喘，蘇子降氣化痰，葶藶子瀉肺平喘，三藥合用可在瀉白散的基礎上清肅肺氣、化痰通絡；桃仁活血潤腸、止咳平喘，矮地茶止咳化痰、利濕活血，兩藥配伍可活血化瘀通絡，與瀉白散相配伍可增降氣平喘之效；甘草祛痰止咳，調(diào)和諸藥。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，實驗第6天，模型組小鼠肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表達水平明顯高于正常組，SOD表達水平明顯低于正常組，提示肺炎支原體肺炎小鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應激反應；實驗第11天，模型組小鼠肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表達水平繼續(xù)上升，SOD表達水平繼續(xù)下降，說明肺炎支原體感染后無藥物干預情況下，小鼠體內(nèi)氧化應激損傷持續(xù)加重。實驗第6天和實驗第11天，清肺通絡方組、阿奇霉素組和中西醫(yī)結(jié)合組肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表達水平均明顯低于模型組，SOD表達水平明顯高于模型組，提示清肺通絡方和阿奇霉素可通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)氧化反應減輕肺炎支原體對機體造成的炎性損害。實驗第6天，阿奇霉素組肺泡灌洗液中NOS、NO、SOD，肺組織中NO、iNOS、MDA，血清中NOS、MDA表達水平降低或升高程度均優(yōu)于清肺通絡方組；實驗第11天，阿奇霉素組與清肺通絡方組各指標比較均無明顯差異。說明阿奇霉素序貫治療第6～10天中對體內(nèi)氧化/抗氧化指標的調(diào)控效果有所下降，為今后臨床減少抗生素的使用提供了新的思考方向。本研究還發(fā)現(xiàn)氧化應激指標在肺泡灌洗液、血清中的表達較為顯著，在臨床上可根據(jù)實際需求選擇檢測標本類型。

綜上所述，清肺通絡方能夠抑制肺炎支原體肺炎小鼠體內(nèi)NOS與iNOS的活力，有效減少NO、MDA生成，提高SOD活力，起到調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)的作用，從而減輕肺部炎癥損傷，且清肺通絡方與阿奇霉素聯(lián)用作用更為顯著。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。