王雪楠，常 宏，喇孝瑾，馬雷雷，李繼安

(華北理工大學中醫(yī)學院,河北 唐山 063210)

2型糖尿病是一種病因復雜、具有遺傳易感性、以糖代謝紊亂為主的代謝性疾病。研究顯示胰島素抵抗和活性氧(ROS)過量引起的氧化應激是2型糖尿病發(fā)病和并發(fā)癥產(chǎn)生的主要因素[1],二者相互影響,ROS 產(chǎn)生過多不僅僅是胰島素抵抗的結(jié)果,而且是胰島素抵抗的一個危險因子。而具有抗氧化性的超氧化物歧化酶(SOD)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)可通過調(diào)節(jié)ROS的平衡保護機體免受ROS導致的氧化損傷[2]。課題組前期研究證實,以施今墨對藥為主配伍的中藥復方具有良好的降糖效果[3]。為此,本實驗以氧化應激為切入點,觀察施今墨對藥配方對2型糖尿病大鼠血糖、血清C肽、游離脂肪酸(FFA)、SOD、MDA和胰島素抵抗的影響,初步探尋其治療2型糖尿病的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性Wistar大鼠,SPF級,體重(180±10)g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)于華北理工大學中醫(yī)學院動物實驗室，室溫20～25 ℃,相對濕度40%～50%。

1.2藥物與試劑 施今墨對藥配方:按黃連5、肉桂3、葛根3、丹參3、蒼術(shù)3、生地3、厚樸3、桑白皮5、黃芪3、五味子7.5、菟絲子10、萊菔子10、天花粉3、玄參3的比例配伍。以上中藥飲片購于唐山市同仁堂藥店,經(jīng)鑒定為正品。加8倍量水煎煮2 h,將2次藥液混合后加熱濃縮成混懸液,置于4 ℃冰箱,根據(jù)高、中、低劑量和大鼠體重配制成對應劑量混懸液。二甲雙胍片(上海施貴寶制藥有限公司,AAW6090)。鏈脲佐菌素(STZ,Sigma-S0130,CAS#18883-66-4);大鼠C肽檢測試劑盒(江蘇酶標生物,MB-2129A)，SOD檢測試劑盒(南京建成,20180912)，F(xiàn)FA檢測試劑盒(南京建成,20180907)，MDA檢測試劑盒(南京建成,20180912)。

1.3儀器 穩(wěn)益血糖儀(長沙三諾公司);JJ1000型電子天平(常熟雙杰測試儀器廠);Centrifuge 5430R離心機(Eppendorf公司);infinite M200 pro酶標儀(Tecan公司);SK-0180-E圓周搖床(美國Scilogex公司)。

1.4實驗方法 50只Wistar大鼠普通料適應飼養(yǎng)1周后,隨機選取6只作為正常組,普通飼料飼養(yǎng),不限食水；余44只參照文獻[4-6]方法造模：給予5%葡萄糖飲水+高脂飼料飼養(yǎng)4周,不限食水，之后腹腔注射STZ 35 mg/kg 誘導，以空腹血糖(FPG)≥11.1 mmol/L及餐后2 h血糖(2hPG)≥16.7 mmol/L為成模標準,剔除死亡及未達標大鼠,共成模30只。將30只糖尿病大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組及施今墨對藥配方高、中、低劑量組, 每組6只。按人與大鼠的體表面積比換算成人所用藥量[7]，每天8:00，二甲雙胍組給予1 g/kg二甲雙胍灌胃，施今墨對藥配方高、中、低劑量組給予23.2 g/kg、11.6 g/kg、5.8 g/kg施今墨對藥配方灌胃,正常組和模型組灌胃等量生理鹽水，,每周日8:00稱體重并及時調(diào)整灌胃量,連續(xù)8周。

1.5檢測指標 分別于干預前(0周)及干預8周后8:00，以75%乙醇消毒實驗大鼠尾尖部,采血針取血,檢測FPG和2hPG,隨后稱體重并記錄。干預8周后腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠,腹主動脈取血8 mL,室溫靜置2.5 h后3 000 r/min離心15 min存上清，按測試盒方法檢測SOD、FFA、MDA水平，ELISA法檢測大鼠C肽水平并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。HOMA-IR=1.5+FPG×空腹C肽/2 800[8]。

1.6統(tǒng)計學方法 采用Prism6軟件做圖，實驗結(jié)果用SPSS 24.0軟件分析,多組間比較用單因素方差分析,2組相比用獨立樣本t檢驗,方差齊用LSD法,方差不齊用T3法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠干預前后體重和血糖比較 干預前，各組大鼠體重比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組、二甲雙胍組及施今墨對藥配方各組FPG和2hPG均明顯高于正常組(P均<0.05)，但各造模組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。干預8周后,模型組、二甲雙胍組及施今墨對藥配方各組大鼠體重均明顯低于正常組(P均<0.05),FPG和2hPG仍明顯高于正常組(P均<0.05);與模型組比較，二甲雙胍組和施今墨對藥配方低劑量組大鼠體重明顯增高(P均<0.05),二甲雙胍組和施今墨對藥配方中、低劑量組大鼠FPG和2hPG均明顯降低(P均<0.05),施今墨對藥配方高劑量組僅2hPG明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.2各組大鼠血清FFA、SOD、MDA水平比較 模型組和施今墨對藥配方各組血清FFA、MDA水平均明顯高于正常組(P均<0.05),模型組血清SOD水平明顯低于正常組(P<0.05)，二甲雙胍組和施今墨對藥配方各組血清SOD水平與正常組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。二甲雙胍組和施今墨對藥配方中、低劑量組血清FFA、MDA水平及施今墨對藥配方高劑量組血清MDA水平均明顯低于模型組(P均<0.05),二甲雙胍組和施今墨對藥配方各組血清SOD水平均明顯高于模型組(P均<0.05)。見圖2。

2.3各組大鼠血清C肽水平和HOMA-IR比較與正常組比較,模型組大鼠血清C肽水平降低而HOMA-IR升高(P均<0.05)；與模型組比較,二甲雙胍組和施今墨對藥配方各組血清C肽水平明顯高于模型組(P均<0.05)，二甲雙胍組和施今墨對藥配方低劑量組HOMA-IR均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3及圖4。

3 討 論

全球糖尿病地圖(IDF Diabetes Atlas)第8版報告指出,2017年全球糖尿病患者約4.25億,中國患者數(shù)位居第一，預測到2045年,糖尿病患者會達到6.29億[9]。因此，糖尿病防治研究刻不容緩。2型糖尿病患者一方面以胰島素抵抗為病理基礎,胰島素抵抗導致體內(nèi)血糖、血脂利用減少,血糖增高、脂肪堆積、FFA水平增高,FFA的異常升高對機體有脂毒性,高FFA刺激ROS的產(chǎn)生,而過量的ROS又導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA異常增加,清除氧自由基的SOD減少,使機體氧化與抗氧化處于失衡狀態(tài),啟動氧化應激機制并激活炎癥細胞產(chǎn)生更多的自由基,引發(fā)氧化應激進而損傷體內(nèi)的β細胞;另一方面,氧化應激能干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導并導致胰島素抵抗,并且是引發(fā)2型糖尿病并發(fā)癥的主要因素[10-11]。MDA 為機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物,其含量反映了機體細胞被自由基攻擊的嚴重程度,是評價氧化損傷的關鍵指標[12]。SOD是機體內(nèi)的主要氧自由基清除因子,其活性反映了機體抗氧化能力，可通過歧化反應將超氧化物催化為氧氣和過氧化氫,阻斷氧自由基對細胞的損害,同時可修復氧自由基損傷的細胞[13]。為此,本實驗以FFA、SOD、MDA及HOMA-IR為主要指標,觀察施今墨對藥配方對上述指標的影響,初步探索該方的療效機制。

施今墨對藥配方是根據(jù)施今墨治療2型糖尿病臨床經(jīng)驗,以清肺胃熱、補脾腎虛、化痰降濁為原則擬定的配方[3]。方中黃連配桑白皮清瀉肺胃之熱為主藥,黃連配肉桂清火溫腎，水火濟濟，引火歸元；蒼術(shù)配玄參為燥濕健脾化濁與滋陰降火配伍,燥潤相濟、升降相依；葛根配丹參為升陽生津與苦降活血相伍；佐以五味子、萊菔子和菟絲子斂肺補脾益腎、理氣化痰,全方配伍切合該病病機。從中藥治療胰島素抵抗的用藥規(guī)律分析發(fā)現(xiàn),治療主藥包括黃芪、黃連、白術(shù)、蒼術(shù)等[14]。其中黃芪的主要成分黃芪多糖能增強SOD活性, 改善胰島素抵抗[15]。黃連的主要成分黃連素可通過作用于FFA以改善胰島素抵抗,起到降糖效果[16]。蒼術(shù)-玄參配伍的多糖和正丁醇提取物能增強SOD活性,降低糖尿病小鼠血糖[17]。葛根素與丹參酮ⅡA聯(lián)合用藥能增強機體抗氧化能力,減少氧化應激損傷[18]；葛根素還可通過上調(diào)PI3K基因及蛋白表達促進GLUT4葡萄糖轉(zhuǎn)運,改善3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型的胰島素抵抗狀態(tài)[19]；臨床研究亦發(fā)現(xiàn)葛根素能影響2型糖尿病患者的SOD、MDA水平,改善胰島素抵抗[20]。上述研究提示,施今墨對藥配方不僅切合中醫(yī)病機，而且具有治療2型糖尿病胰島素抵抗并改善氧化應激的理論依據(jù)。

2型糖尿病動物模型是進行本實驗的基礎,根據(jù)2型糖尿病患者發(fā)病特征并參考動物模型制備文獻[4-6],采用Wistar大鼠高糖高脂飼養(yǎng)+腹腔注射STZ的方法制備2型糖尿病大鼠模型,所制備的模型動物FPG、2hPG明顯增高,具備了2型糖尿病的基本特征。給予相應藥物干預8周，顯示施今墨對藥配方可降低FPG、2hPG、FFA、MDA水平，增加SOD活性,改善氧化應激損傷;可以升高C肽，降低HOMA-IR,有效改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗。由此說明,施今墨對藥配方可有效降低血糖，改善脂代謝,其作用機制與調(diào)節(jié)FFA、SOD、MDA及胰島素抵抗密切相關。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。