李小芬 方镕澤 馮 華 王祥培*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611130；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.遵義市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 遵義 563002

桑寄生為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.)Danser的干燥帶葉莖枝，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎元等功效，用于風(fēng)濕痹痛，腰膝酸軟、筋骨無(wú)力、崩漏經(jīng)多、妊娠漏血、胎動(dòng)不安、頭暈?zāi)垦５劝Y[1]。桑寄生始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，是臨床常用的祛風(fēng)濕藥，而其補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等作用在臨床上應(yīng)用也非常廣泛，已經(jīng)被歷代的醫(yī)家在實(shí)踐中證實(shí)[2-4]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，古典理論認(rèn)為的“肝藏血”“腎藏精”以及“肝主筋”“腎主骨”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究能夠完全契合，為臨床運(yùn)用“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”法則治療筋骨疾病提供了可靠依據(jù)[5]。腎氣旺盛，腎精充足，骨骼則健壯，骨髓生化有源，四肢百骸功能正常；肝血充盛，筋骨得到充沛的濡養(yǎng)，才能強(qiáng)健有力。因此，臨床上補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨是骨質(zhì)病變的主要治法之一[6]。桑寄生主要含黃酮類(lèi)、生物堿、萜類(lèi)、多糖、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分，其中黃酮類(lèi)成分為主要活性成分[7-9]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，桑寄生水煎液可抑制骨吸收，提高骨質(zhì)量，改善骨代謝的負(fù)平衡狀態(tài)，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的作用。體外研究[10]表明，黃酮類(lèi)物質(zhì)可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成，起到抗骨質(zhì)疏松的作用。目前，有關(guān)桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的藥效研究已有報(bào)道[9,11]，但從細(xì)胞及分子水平系統(tǒng)全面的揭示桑寄生以何種途徑發(fā)揮“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”作用的分子機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道，亟待進(jìn)一步加強(qiáng)。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥(理、法、方、藥)由于缺乏分子生物學(xué)的表征，無(wú)法發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，難以與現(xiàn)代科學(xué)有機(jī)的融合[12]。近年來(lái)，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起，它主要是通過(guò)構(gòu)建和整合“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”多層次網(wǎng)絡(luò)，分析特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，從系統(tǒng)、整體角度探索藥物與機(jī)體相互作用的一門(mén)新學(xué)科[13-14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認(rèn)為是一種提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，節(jié)省藥物研發(fā)費(fèi)用的新方法，尤其有助于闡明多組分和多靶標(biāo)之間潛在的復(fù)雜關(guān)系，而其整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)更是與中藥“多成分、多途徑、多靶點(diǎn)”協(xié)同作用的特點(diǎn)不謀而合，為中醫(yī)藥復(fù)雜系統(tǒng)的研究提供了新的思路[15-16]。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘、篩選、構(gòu)建桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”作用的“中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，探討桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的作用機(jī)制，以期為桑寄生傳統(tǒng)功效作用機(jī)制的闡釋提供參考依據(jù)。技術(shù)路線如圖1所示。

1 方法

1.1 化學(xué)成分的收集 通過(guò)查閱《中華本草》、 中國(guó)知網(wǎng)(CNKI, http://kns.cnki.net/kns/brief/default_result.aspx)、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)TCMID (http://www.megabionet.org/tcmid/)和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP, http://lsp.nwu. edu.cn/tcmsp.php)，搜索桑寄生所有化學(xué)成分。

1.2 活性成分的篩選 口服生物利用度(oral bioavailability，OB) 是評(píng)估藥物能否開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵參數(shù)，也是評(píng)價(jià)中藥臨床療效的有效指標(biāo)。類(lèi)藥性( drug likeness，DL) 目前被廣泛用于評(píng)價(jià)先導(dǎo)化合物藥物是否有可能成藥的重要依據(jù)。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中認(rèn)為 OB>30%的分子具有較好的口服生物利用度，DL>0.18的分子具有較好的類(lèi)藥性[17]。將桑寄生所有化學(xué)成分，以ADME(吸收、分布、代謝、排泄)參數(shù)(OB≥30%和 DL≥0.18)或生物活性(文獻(xiàn)已有報(bào)道)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選桑寄生的活性化學(xué)成分。然后通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索活性化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式。

1.3 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的建立 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss TargetPrediction(http://www.swissta rgetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索桑寄生活性化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，建立活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過(guò)人類(lèi)基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM，http://www.omim.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)以“Bone weakness”“waist and knee pain”“Liver and kidney deficiency”和“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”相關(guān)的靶點(diǎn)，建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。最后將篩選得到的所有靶點(diǎn)均經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)查詢(xún)轉(zhuǎn)化成UniProt ID格式。

1.4 核心靶點(diǎn)的篩選及網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集，存在交集中的靶點(diǎn)即為桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將其導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)中構(gòu)建“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，并采用cytoscape 3.6.1 軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，以網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)“節(jié)點(diǎn)連接度”(Degree)、“節(jié)點(diǎn)介度”(Betweenness centrality)、“節(jié)點(diǎn)緊密度”(Closeness centrality)的中位數(shù)為卡值，選取同時(shí)滿(mǎn)足大于3個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)，作為桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的核心靶點(diǎn)；同時(shí)采用cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 生物過(guò)程分析 將核心靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.6.1軟件的ClueGO插件中進(jìn)行基因本體(GO)生物學(xué)過(guò)程和基于京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析，以P≤0. 01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出具有極顯著性差異的生物過(guò)程和信號(hào)通路。

1.6 構(gòu)建桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”作用的通路圖 運(yùn)用KEGG (https://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的KEGG Mapper功能，將核心靶點(diǎn)映射在相關(guān)信號(hào)通路上，揭示桑寄生多靶點(diǎn)、多途徑的治療作用。

2 結(jié)果

2.1 桑寄生活性成分的篩選 從《中華本草》、中國(guó)知網(wǎng)、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中得到目前桑寄生已報(bào)道的58個(gè)化學(xué)成分，根據(jù)ADME參數(shù)(OB≥30%和 DL≥0.18)或生物活性(文獻(xiàn)已有報(bào)道)為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選得到8個(gè)桑寄生活性化合物，并下載其結(jié)構(gòu)式，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 桑寄生活性化合物的相關(guān)參數(shù)及結(jié)構(gòu)式

表1 桑寄生活性化合物的相關(guān)參數(shù)及結(jié)構(gòu)式

2.2 桑寄生活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將 TCMSP、Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的所有靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到8個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，共計(jì)358，結(jié)果見(jiàn)表1。在OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“Bone weakness”“waist and knee pain”“Liver and kidney deficiency”和“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索整合得到1535個(gè)“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。最后將篩選得到的所有靶點(diǎn)均經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)轉(zhuǎn)化成UniProt ID格式。

2.3 桑寄生核心靶點(diǎn)的篩選 將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集，得到88個(gè)交集靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖，結(jié)果如圖2所示。將交集靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并采用cytoscape 3.6.1 軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，得到所有節(jié)點(diǎn)3個(gè)拓?fù)鋮?shù)的中位數(shù)值分別為15(Degree)、0.0042(Betweenness centrality)、0.5119(Closeness centrality)，選取同時(shí)滿(mǎn)足大于3個(gè)拓?fù)鋮?shù)中位數(shù)值的節(jié)點(diǎn)，作為桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的核心靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表2；同時(shí)采用cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建“核心靶點(diǎn)”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖3所示。

表2 桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”核心靶點(diǎn)的相關(guān)拓?fù)鋮?shù)

表2 桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”核心靶點(diǎn)的相關(guān)拓?fù)鋮?shù)

2.4 桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)cytoscape 3.6.1 軟件分別構(gòu)建“中藥-活性成分”網(wǎng)絡(luò)、“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，將以上網(wǎng)絡(luò)合并成為一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，最終構(gòu)建“中藥-活性成分-核心靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖4所示。

2.5 GO生物過(guò)程富集分析 將33個(gè)核心靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.6.1軟件的ClueGO插件中進(jìn)行GO生物過(guò)程富集分析，保留P≤0.01的結(jié)果，進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果共富集得到 68個(gè)生物過(guò)程，根據(jù)Term P-value越小，Term可靠性越高的原則，列舉了排名前20的生物過(guò)程，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的作用主要可能是通過(guò)調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞分化，活性氧生物合成過(guò)程，對(duì)生長(zhǎng)激素的反應(yīng)，胰島素樣生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路，肽基酪氨酸自磷酸等多個(gè)生物過(guò)程而起到治療功效，體現(xiàn)了中藥多途徑的治療作用。

2.6 KEGG通路富集分析 將33個(gè)核心靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.6.1軟件的ClueGO插件中進(jìn)行KEGG通路富集分析，保留P≤0.01的結(jié)果，進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)核心基因在通路中占的個(gè)數(shù)越多，信號(hào)通路越重要，列舉了排名前20的信號(hào)通路，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果共富集得到 59條信號(hào)通路，其中主要的信號(hào)通路包括NF-κB信號(hào)通路，長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)途徑，破骨細(xì)胞分化，C型凝集素受體信號(hào)通路，JAK-STAT信號(hào)通路，雌激素信號(hào)通路，催乳素信號(hào)通路，甲狀腺激素信號(hào)通路，松弛素信號(hào)通路等，提示桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的作用可能是以上多條信號(hào)通路參與的結(jié)果。

表3 桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”排名前20的信號(hào)通路富集結(jié)果

表3 桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”排名前20的信號(hào)通路富集結(jié)果

2.7 桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”作用的通路注釋圖 將33個(gè)核心靶點(diǎn)輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的KEGG Mapper功能中，標(biāo)注出核心靶點(diǎn)在每條相關(guān)信號(hào)通路中所占的個(gè)數(shù)。結(jié)果顯示有8個(gè)靶點(diǎn)蛋白參與雌激素信號(hào)通路的相關(guān)調(diào)控，揭示桑寄生多靶點(diǎn)、多途徑的治療作用，結(jié)果如圖8所示。

3 討論

桑寄生強(qiáng)筋骨的作用被歷代醫(yī)家所認(rèn)可，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為肝臟是多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的中樞，也是人體維生素、激素等代謝的場(chǎng)所，這就是中醫(yī)理論所說(shuō)的“肝藏血”。腎臟影響維生素D的形成及控制鈣、磷等元素的代謝，這就是中醫(yī)理論所說(shuō)“腎主骨生髓”的作用。中醫(yī)理論認(rèn)為“肝主筋”“腎主骨”“肝腎同源”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究能夠完全契合，而其強(qiáng)筋骨作用與補(bǔ)肝腎作用密切相連，是補(bǔ)肝腎作用的體現(xiàn)和應(yīng)用[5,18]。鄭磊等[6]從“肝主筋”“腎主骨”“肝腎同源”3個(gè)方面探討了“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的作用機(jī)制，結(jié)果表明其主要與肝臟能量代謝、核酸代謝，腎臟影響維生素D的形成、激素、鈣、磷代謝等生理過(guò)程相關(guān)，為“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的現(xiàn)代研究提供了可靠依據(jù)。

本研究預(yù)測(cè)出桑寄生主要有效成分為槲皮苷、槲皮素、沒(méi)食子酸、維生素C、萹蓄甘、β-谷甾醇等，主要為黃酮類(lèi)成分。研究[19]表明，萹蓄苷、槲皮苷為桑寄生補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨功效的代表性成分。桑寄生中槲皮素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和新生血管生成[20]，槲皮苷具有抑制乙酰膽堿酶和蘇氨酸激酶等作用[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)桑寄生葉子中富含豐富的維生素C，維生素C具有強(qiáng)烈的生理活性，參與人體多種代謝，是人體必需的維生素之一，具有解毒和改善肝功能、保持肌膚潤(rùn)滑、清除自由基、保護(hù)心臟及血管、抗腫瘤等作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，AKT1、SRC、EGFR、TNF、JUN、PTGS2、ESR1可能為桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的潛在靶點(diǎn)。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 ，該蛋白參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括代謝，增殖，細(xì)胞存活，生長(zhǎng)和血管生成等，均是通過(guò)一系列下游底物的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化來(lái)介導(dǎo)的。AKT激活依賴(lài)于PI3K途徑，并被認(rèn)為是該途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。烏頭湯可改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)，抑制關(guān)節(jié)軟骨中與炎癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，下調(diào)p38 MAPK、JNK、Ras、ERK、iNOS 蛋白含量表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，延緩膝骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程作用[23]。雌激素受體(estrogen receptor，ESR1)可延長(zhǎng)破骨細(xì)胞的存活時(shí)間、減少其凋亡，抑制破骨細(xì)胞的活性和分化，最終達(dá)到抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，防治骨質(zhì)疏松的作用[24]。

GO生物過(guò)程富集分析，表明桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”作用涉及細(xì)胞增殖、代謝過(guò)程、生物合成過(guò)程、炎癥反應(yīng)等生物過(guò)程，其中膠質(zhì)細(xì)胞分化，活性氧生物合成過(guò)程，對(duì)生長(zhǎng)激素的反應(yīng)，胰島素樣生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路，肽基酪氨酸自磷酸可能為桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”作用的主要進(jìn)程。KEGG通路富集分析，表明桑寄生主要是通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)途徑，破骨細(xì)胞分化，C型凝集素受體信號(hào)通路，JAK-STAT信號(hào)通路，雌激素信號(hào)通路，催乳素信號(hào)通路，甲狀腺激素信號(hào)通路，PI3K /AKT信號(hào)通路，MAPK 信號(hào)通路發(fā)揮“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”作用的。在PI3K /AKT 信號(hào)通路中，當(dāng)AKT 及其靶基因激活時(shí)，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，小鼠敲除 AKT1 和 AKT2 基因，會(huì)出現(xiàn)明顯的骨量減少癥狀，提示成骨細(xì)胞可能通過(guò) PI3K /AKT信號(hào)通路促進(jìn)骨形成[25]。MAPK 信號(hào)通路是調(diào)控成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的重要途徑，研究[26]表明其主要包括ESR1通路，p38通路和JNK通路。ESR1信號(hào)通路能上調(diào)成骨細(xì)胞中Osterix mRNA的表達(dá)，抑制骨吸收，升高骨密度。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，構(gòu)建“中藥-有效成分-核心靶點(diǎn)-疾病”“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”的作用機(jī)制涉及多個(gè)生物過(guò)程、多條通路，體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的作用特點(diǎn)。提示桑寄生“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨” 的作用機(jī)制可能是以上靶點(diǎn)和信號(hào)通路共同作用的結(jié)果。但是具體的結(jié)果仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證明。