鐘琦，盛豪，郭俊

（1南通大學第四附屬醫(yī)院神經外科，江蘇鹽城224001；2南通大學醫(yī)學院）

腦膠質瘤是常見的中樞神經系統惡性腫瘤，約占惡性腦腫瘤81%[1]。腦膠質瘤惡性程度高，預后差，高級別膠質瘤生存時間僅1年左右[2]。膠質瘤的治療方法主要為手術切除輔以放化療，近年來出現了基因靶向治療、免疫治療等新的治療方案，但化療仍是決定患者預后的重要手段[3-4]。用于膠質瘤的化療藥物必須具有透過血腦屏障的能力，常見的化療藥物較難發(fā)揮作用[5]。青藤堿（Sinomenine，SIN）是從防己科植物青風藤及毛青藤根莖中提取的生物堿單體，在肺癌、胃癌、肝癌等腫瘤中具有抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的作用[6-8]。本研究探討青藤堿對膠質瘤細胞SHG-44增殖和侵襲的影響，希望能為膠質瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人腦膠質瘤細胞SHG-44（中國科學院細胞庫/干細胞庫），青藤堿（Sigma-Aldrich），DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Wisent），胰蛋白酶（Bio-Froxx），CCK-8試劑盒（Med Chem Express），Transwell小室（Corning），P-ERK抗體、P-JNK抗體和P-STAT3抗體（Cell Signaling Technology），羊抗兔IgG（Biosharp）。

1.2 實驗方法

1.2.1 SHG-44細胞培養(yǎng)：細胞從液氮中復蘇后傳代。取對數生長期并長滿皿底的細胞，PBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化，然后以含10%胎牛血清的DMEM終止消化。離心后按1∶3進行傳代，使用含10%胎牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)約2天可傳下一代。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖：取對數生長期細胞，制成細胞懸液，以5×104個/mL接種于96孔板，每組設置5個復孔。培養(yǎng)24 h后更換含不同濃度（0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L）青藤堿的完全培養(yǎng)基，分別于12 h，24 h和36 h進行吸光度檢測。棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入100μL含10%CCK-8的DMEM，37℃培養(yǎng)箱內孵育1 h，使用酶標儀檢測450 nm波長的吸光度，計算細胞增殖。

1.2.3 Transwell細胞侵襲實驗：在Transwell小室底層鋪上基質膠，37℃下30min使之凝固。制備5×105個/mL細胞懸液，實驗組青藤堿濃度為0.5 mmol/L。Transwell小室中各加入100μL對照組細胞懸液和實驗組細胞懸液，每組3個復孔，小室下層加入600μL含10%胎牛血清的DMEM。Transwell小室放入下層24孔板內，底層培養(yǎng)基沒過Transwell小室的底面和基質膠。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上下層培養(yǎng)基，棉簽擦去Transwell小室的培養(yǎng)基、基質膠和殘余細胞，小室洗滌后，用0.1%結晶紫染色，400倍顯微鏡下拍照。

1.2.4 Western blot檢測：用含β-巰基乙醇的loading buffer裂解細胞，提取總蛋白。電泳后用考馬斯亮藍染色調齊內參，再次電泳、轉膜，將PVDF膜用脫脂牛奶封閉2 h，一抗（1∶2 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶10 000）孵育50 min，加發(fā)光液在成像系統下拍照。

1.3 統計學處理應用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料以±s表示，兩組間比較應用t檢驗，多組間比較應用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 青藤堿抑制SHG-44細胞增殖觀察不同濃度青藤堿、作用不同時間對SHG-44細胞增殖的影響，CCK-8檢測顯示，與對照組（0 mmol/L）相比，0.25 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L、2 mmol/L濃度的青藤堿均顯著抑制膠質瘤細胞的增殖，差異均有統計學意義（P＜0.05），且1 mmol/L已達到最大抑制效應。作用12 h、24 h、36 h都能有效抑制SHG-44細胞的增殖，隨著作用時間的延長，抑制效果愈明顯。提示青藤堿抑制膠質瘤細胞SHG-44的增殖呈時間-劑量依賴關系。見圖1。

圖1 CCK-8檢測SHG-44細胞增殖能力

2.2 青藤堿抑制SHG-44細胞的侵襲細胞增殖實驗顯示，1 mmol/L青藤堿已達到最大抑制效應，為了防止高濃度青藤堿對細胞數量的影響，采用0.5 mmol/L濃度的青藤堿進行侵襲實驗。Transwell侵襲實驗發(fā)現，青藤堿組與對照組相比，SHG-44侵襲能力顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 青藤堿對SHG-44細胞P-JNK、P-ERK及PSTAT3表達的影響Western blot實驗發(fā)現，與對照組比較，青藤堿顯著上調SHG-44細胞內P-JNK、PERK蛋白的表達，下調P-STAT3蛋白的表達，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 Transwell實驗檢測SHG-44細胞侵襲能力

圖3 Western blot檢測P-JNK、P-ERK和P-STAT3蛋白表達水平

3 討 論

膠質瘤起源于星形膠質細胞、神經干細胞和少突膠質前體細胞等[9]，目前主要的治療方法是手術切除，高級別膠質瘤術后輔以放化療[10]。治療后膠質瘤的復發(fā)率較高，可能與手術切除后腫瘤殘留以及對放化療不敏感有關。膠質瘤常用的化療藥物有替莫唑胺、洛莫司汀、甲基芐肼、長春新堿等[11]，近些年中藥在腫瘤中的運用受到人們關注，許多中藥提取物已用于臨床，如紫杉醇已成為乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的一線用藥[12]。青藤堿對腫瘤也有一定的作用，在肺癌、胃癌等腫瘤中已有報道，具有促凋亡、抑制細胞增殖、侵襲以及轉移等作用[6-7]。研究發(fā)現，青藤堿可下調mmp-2、mmp-9來抑制膠質瘤細胞U251的遷移和侵襲[13]。本研究發(fā)現，青藤堿可顯著抑制膠質瘤細胞SHG-44的增殖和侵襲，并呈劑量-時間依賴性。為進一步探究青藤堿的作用機制，我們對相關信號通路的關鍵節(jié)點進行了篩選。實驗發(fā)現青藤堿可下調SHG-44細胞中STAT3磷酸化水平，STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）是一種胞質信號分子，也是胞核轉錄因子，參與細胞的增殖、轉化及遷移等過程[14]。STAT3過表達及磷酸化水平與腫瘤進展、患者不良生存預后密切相關[15]。在正常情況下，由于激活STAT的蛋白抑制劑（protein inhibitor of activated STAT，PIAS）、細胞因子信號抑制劑（suppressors of cytokine signaling，SOCS）以及幾種蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）固有的抑制作用，STAT3信號轉導較低。一旦被上游信號激活，STAT3蛋白Tyr705處的酪氨酸殘基就會磷酸化，導致STAT3發(fā)生核轉位，隨后STAT3下游靶基因開始轉錄。STAT3作為一種癌基因，是許多由細胞因子、生長因子或腫瘤蛋白觸發(fā)的信號通路的匯合點[16]。青藤堿可能通過抑制STAT3磷酸化，從而抑制膠質瘤細胞SHG-44的增殖和侵襲。本研究發(fā)現，青藤堿也可上調磷酸化JNK、磷酸化ERK。c-Jun N末端激酶（JNK）是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的亞家族，調節(jié)重要的細胞活動，包括細胞增殖，分化和凋亡[17]。所有MAPK都需要對其激活環(huán)進行磷酸化才能發(fā)揮全部催化活性。完整的JNK活性需要JNK激活環(huán)TPY基序內的Thr和Tyr雙重磷酸化，去除任何一種磷酸鹽都會降低JNK對所有底物的活性[18]。ERK作為有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途徑（通常稱為RAS-RAF-MEKERK信號級聯）的重要環(huán)節(jié)，起著很重要的調節(jié)作用。MAPK途徑的功能是將上游信號傳遞至其下游效應分子，以調節(jié)生理過程，例如細胞增殖，分化，存活和死亡[19]。ERK1/2位于未刺激細胞的細胞質中，一旦激活，ERK1/2就轉移到細胞核，并通過磷酸化調節(jié)各種轉錄因子的活性，最終調節(jié)細胞的代謝和功能，并影響細胞特定生物學效應[20]。青藤堿上調PJNK、P-ERK的表達，可能是通過JNK途徑或者MAPK途徑抑制膠質瘤的增殖和侵襲。

綜上所述，青藤堿明顯抑制膠質瘤細胞SHG-44增殖和侵襲，可能與調控P-JNK、P-ERK和PSTAT3表達水平有關。P-JNK、P-ERK和P-STAT3三者可能存在相互聯系或上下游關系，在后續(xù)研究中進一步驗證，并采用體內實驗更全面、深入研究青藤堿對于膠質瘤的作用。