王成云，褚乃清，李泳濤，沈雅蕾，林君峰，謝堂堂

（深圳海關(guān)工業(yè)品檢測技術(shù)中心，深圳 518067）

皮革及其制品中含有抗菌劑，以期提高產(chǎn)品的防霉變性能，異噻唑啉酮類抗菌劑作為一類廣譜、高效的抗菌劑，常用于皮革及其制品的防霉處理[1-4]。異噻唑啉酮類抗菌劑首先由美國Rohm&Haas公司取得專利權(quán)，開發(fā)出性能優(yōu)良的成熟產(chǎn)品。作為一類非氧化型抗菌劑，異噻唑啉酮類抗菌劑對受體細(xì)胞膜和細(xì)胞壁具有很強(qiáng)的穿透能力，可穿透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與含有巰基(-SH)的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生產(chǎn)S-S鍵，破壞細(xì)胞的再生繁殖，導(dǎo)致其死亡[5-6]。但是，大量研究結(jié)果表明，部分異噻唑啉酮類抗菌劑對人體和環(huán)境有害，對水生動(dòng)物具有急性毒性[7-9]，長期接觸時(shí)可引發(fā)接觸性皮炎、濕疹、皮膚灼傷、哮喘[10-22]，職業(yè)性接觸時(shí)甚至可引起中毒性肝病死亡[23]。有鑒于此，各國立法限制使用部分異噻唑啉酮類抗菌劑[24-25]。目前限制使用的異噻唑啉酮類抗菌劑共有7種：4，5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮(DCOI)、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MI)、2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮(OI)、2-丁基-1，2-苯并異噻唑啉-3-酮(BBIT)、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMI)、2-甲基-1，2-苯并異噻唑啉-3-酮(MBIT)、1，2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)。皮革及其制品中異噻唑啉酮類抗菌劑的測試已有文獻(xiàn)報(bào)道[26-29]，但測試對象并未涵蓋全部7種限用異噻唑啉酮類抗菌劑。串聯(lián)質(zhì)譜法采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行定量，受基體干擾少，定量下限低[30-36]。本文采用超聲萃取-固相萃取柱凈化-氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)，建立了1個(gè)氣質(zhì)聯(lián)用分析方法，對皮革及其制品中7種異噻唑啉酮類抗菌劑進(jìn)行了同時(shí)測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

用色譜純甲醇(美國Fisher Scientific公司)將DCOI(純度99.8%、日本東京化成株式會(huì)社)、MBIT (純度98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)、MI(純度99.5%、美國Sigma-Aldrich公司)、BBIT(純度95.0%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)、CMI (純度99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)、OI(美國純度99.9%，Sigma-Aldrich公司)、BIT(純度99.2%，美國Sigma-Aldrich公司)配制為混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其中OI、BBIT、MBIT、BIT、CMI、DCOI、MI的質(zhì)量濃度分別為19.19、20.49、20.75、38.40、39.20、39.67、40.23 g/mL。用甲醇將其逐級稀釋，配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

陽性樣品為市售黑色牛皮革，該樣品中同時(shí)檢出MI和CMI。將樣品剪成小塊，用Retch SM2000織物研磨儀(德國Retch公司)磨成粉末。稱取1.0 g粉末樣品，置于裝有25 mL甲醇的35 mL玻璃反應(yīng)瓶中，用MJ-600超聲波清洗機(jī)(無錫市美極超聲設(shè)備有限公司)超聲萃取25 min，萃取溫度為40 ℃。過濾，用雞心瓶收集濾液。將雞心瓶轉(zhuǎn)移至RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廣州華馨科學(xué)儀器有限公司)中，在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。將雞心瓶轉(zhuǎn)移至DCY-12氮吹儀(常州市萬合儀器制造有限公司)中，用干燥氮?dú)饩徛蹈桑瑲堅(jiān)? mL甲醇溶解。用5 mL甲醇對Supelclean LC-Ph固相萃取柱(0.5 g/3 mL，美國supelco公司)進(jìn)行預(yù)活化處理后，將所得溶液轉(zhuǎn)移到萃取柱中，用5 mL甲醇淋洗，收集流出液。將流出液在RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，在DCY-12氮吹儀中用干燥氮?dú)饩徛蹈珊螅?mL甲醇溶解殘留物[37-39]，所得溶液用0.45 m濾膜(德國CNW Technologies公司)過濾后供GC/MS-MS分析用。

采用Shimazdu GCMS-TQ 8040MX氣質(zhì)聯(lián)用儀(日本Shimazdu公司)進(jìn)行測試。色譜分離在RXi-5MS(30 m0.25 mm0.25 m)色譜柱上進(jìn)行，采用不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量為1L。程序升溫方式，初溫為90 ℃，以15 ℃/min的速度升至280 ℃，保持3 min。溶劑遲延為3min。進(jìn)樣口溫度和傳輸線溫度分別為270 ℃、280 ℃。載氣為高純氮?dú)?純度＞99.999%)，載氣流速為1.1 mL/min。

質(zhì)譜條件為：電子轟擊(EI)電離方式，電離能為70 eV，離子源溫度和四極桿溫度分別為210 ℃和150 ℃，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲萃取條件的優(yōu)化

影響超聲萃取效率的主要因素有5個(gè)：萃取溫度、萃取溶劑種類、萃取時(shí)間、萃取方式、萃取溶劑體積[36-37，40-44]。首先考察萃取溫度(因素A)、萃取時(shí)間(因素B)和萃取溶劑體積(因素C)對萃取量的影響[41]。使用甲醇作為萃取溶劑對陽性樣品進(jìn)行單次超聲萃取，只改變其中1個(gè)因素而另外2個(gè)因素維持不變，觀察萃取量的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萃取量隨這3個(gè)因素變化而變化規(guī)律相同，當(dāng)萃取溫度(萃取時(shí)間、萃取溶劑體積)增加時(shí)，萃取量逐漸增加并達(dá)到最大值，繼續(xù)增加時(shí)，萃取量反而有所下降。萃取量達(dá)到最大值時(shí)對應(yīng)的萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取溶劑體積分別為40 ℃、30 min、25 mL。設(shè)計(jì)了表2所示的三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)來考察這3個(gè)因素對萃取量的綜合影響，在表2給出的每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下以甲醇為萃取溶劑對陽性樣品進(jìn)行單次超聲萃取，測定其萃取量，結(jié)果見表3。該陽性樣品中同時(shí)檢出MI和CMI，對于MI和CMI，利用表3中的數(shù)據(jù)分別計(jì)算因素A、因素B和因素C的k值和極差，從而確定其優(yōu)方案[45]。計(jì)算結(jié)果表明，對于MI和CMI，優(yōu)方案均為A1B2C1。在此優(yōu)方案給定的萃取條件下，以甲醇為萃取溶劑，對陽性樣品進(jìn)行連續(xù)3次超聲萃取，測定每次的萃取量和總萃取量。對于MI，3次萃取量分別為1.95、0.04、0.00 mg/kg；對于CMI，3次萃取量分別為3.51、0.10、0.00 mg/kg。經(jīng)1次萃取后，98.0%的MI和97.2%的CMI被萃取出來?？梢?，單次超聲萃取可將待測樣品中的目標(biāo)分析物基本萃取完全。萃取溶劑種類是決定萃取效果主要的因素，由于皮革及其制品中含有大量的脂類物質(zhì)，而脂類物質(zhì)易溶于正己烷、丙酮、叔丁基甲醚、石油醚等弱極性溶劑，采用這些弱極性溶劑作為萃取溶劑時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量伴生雜質(zhì)被萃取出來，嚴(yán)重干擾目標(biāo)分析物的測試。為此選擇水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯等極性較強(qiáng)的溶劑作為萃取溶劑，對陽性樣品進(jìn)行單次超聲萃取，MI和CMI的萃取量見表4。對于MI和CMI，甲醇的萃取效果均最好。因此，超聲萃取條件最終優(yōu)化如下：采用單次萃取方式，以甲醇為萃取溶劑，萃取溫度為40 ℃，萃取時(shí)間為25 min，萃取溶劑體積為25 mL。

表1 MRM條件

表2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2 凈化條件的優(yōu)化

固相萃取柱(SPE)凈化技術(shù)基于液-固相色譜理論[46]，利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進(jìn)行富集、分離和凈化。固相萃取柱的凈化效果主要取決于填料和容量，填料是色譜吸附劑，分為以硅膠為基質(zhì)、以高聚物為基質(zhì)、以無機(jī)材料為主三大類；吸附劑在吸附目標(biāo)化合物時(shí)，也會(huì)吸附同類性質(zhì)的雜質(zhì)，容量過低時(shí)會(huì)導(dǎo)致回收率偏低。不同固相萃取柱對同一目標(biāo)分析物的凈化效果各不相同[28-31]。經(jīng)固相萃取柱凈化后，往往會(huì)損失部分目標(biāo)分析物，也可能引入新的雜質(zhì)。采用16種常見的固相萃取柱對混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行凈化，測定各色譜峰面積，并與未經(jīng)凈化處理的色譜峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算凈化后的回收率，結(jié)果見表5。從表5可知，經(jīng)16種常用固相萃取柱凈化處理后，7種目標(biāo)分析物均有所損失，其中1#柱Supelclean LC-Ph柱(0.5 g/3mL)損失最少，回收率均大于95%。對經(jīng)這16種固相萃取柱凈化處理后的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)1#柱處理后所得譜圖基本無雜質(zhì)峰出現(xiàn)，基線平穩(wěn)。因此最終選擇1#柱進(jìn)行凈化處理。

表3 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

表4 不同溶劑的萃取效果/mg/kg

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC/MS-MS總離子流圖

2.3 分析條件的優(yōu)化

混合物中各組分在色譜柱固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)各不相同，進(jìn)行色譜分離時(shí)，各組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)分配，從而使各組分獲得分離。影響色譜柱分離效果的主要因素是固定相的組成和色譜柱長度?？疾霥B-5HT (30 m 0.25 mm 0.10 m)、RXi-5MS (30 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-17MS (30 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-Wax (30 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-5MS (60 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-5MS (30 m 0.25 mm 0.25 m)、DB-624(30 m 0.25 mm4.10 m)、DB-Wax(60 m 0.25 mm 0.25 m)等8種常見色譜柱對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RXi-5MS色譜柱的分離效果最好。改變升溫程序，觀察各組分的分離情況，在最佳升溫程序下，7種異噻唑啉酮類抗菌劑完全分離。

表5 經(jīng)和未經(jīng)固相萃取柱凈化后的回收率

對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描質(zhì)譜分析，得到總離子流圖，確定7種異噻唑啉酮類抗菌劑的保留時(shí)間和一級碎片離子。對于每種異噻唑啉酮類抗菌劑，選擇強(qiáng)度較高的2～3個(gè)一級碎片離子作為母離子，對其進(jìn)行轟擊，產(chǎn)生二級碎片離子，所用碰撞電壓為15V。母離子與其產(chǎn)生的每個(gè)二級碎片離子可以組成一個(gè)子離子對。觀察每個(gè)子離子對的強(qiáng)度，對于每個(gè)母離子，選擇強(qiáng)度較大的2～3個(gè)子離子對用于MRM條件優(yōu)化。采用分段掃描方式進(jìn)行質(zhì)譜分析，共設(shè)立3個(gè)時(shí)間段，分別為3.0～5.5 min、5.5～8.0 min、8.0～15.5 min。每個(gè)時(shí)間段內(nèi)設(shè)立多個(gè)掃描通道，為了提高每個(gè)子離子對數(shù)據(jù)的采集質(zhì)量，每個(gè)子離子對使用1個(gè)單獨(dú)的掃描通道。碰撞電壓從5V增加到50V，步長為5V，觀察每個(gè)子離子對的強(qiáng)度在不同碰撞電壓下的變化。對于每種異噻唑啉酮類抗菌劑，選擇強(qiáng)度最大的2個(gè)子離子對用于定性定量分析，其中強(qiáng)度最大的子離子對用于定量分析，這2個(gè)子離子對的碰撞電壓就是優(yōu)化碰撞電壓。表1給出了7種異噻唑啉酮類抗菌劑的MRM條件，在此條件下對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，得到其MRM總離子流圖，如圖1所示。圖1中7種目標(biāo)分析物譜峰完全分離，各譜峰峰形尖銳，對稱性好。

表6 線性關(guān)系和定量下限(LOQ)

圖2 1個(gè)陽性樣品的GC/MS-MS圖

2.4 線性關(guān)系和定量下限

按1.3給出的分析條件對系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測試，獲得混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中各組分的峰面積(A)，用峰面積對質(zhì)量濃度()作圖，結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度()范圍內(nèi)，峰面積(A)與質(zhì)量濃度()之間存在良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.9992。表6給出了7種異噻唑啉酮類抗菌劑的線性關(guān)系。在10倍信噪比(S/N=10)的條件下確定方法的定量下限，OI、BBIT、MBIT的定量下限均為0.05 mg/kg、BIT、CMI、DCOI、MI的定量下限均為0.10 mg/kg。

2.5 回收率和精密度

采用空白樣品加標(biāo)回收的方法來確定方法的回收率和精密度[32]，所用空白樣品分別為不含目標(biāo)分析物的牛皮革、羊皮革和豬皮革，分別添加3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備測試樣，每個(gè)添加濃度水平各制備9個(gè)測試樣。對各測試樣進(jìn)行測試，測定各組分的含量，計(jì)算各組分的加標(biāo)平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=9)。方法的精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=9)來表述，結(jié)果見表7。7種異噻唑啉酮類抗菌劑的加標(biāo)平均回收率為80.25%～95.86%，方法精密度為2.84%～12.75%。

表7 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

2.6 實(shí)際樣品測試

對市售皮革及皮革制品樣品中異噻唑啉酮類抗菌劑含量進(jìn)行測試[28-29]，測試樣品共32個(gè)，包括牛皮及牛皮制品樣品17個(gè)、羊皮及羊皮制品樣品8個(gè)、豬皮及豬皮制品樣品7個(gè)，結(jié)果在1個(gè)樣品中同時(shí)檢出MI和CMI，其余31個(gè)樣品中未檢出異噻唑啉酮類抗菌劑。陽性樣品為黑色牛皮革，圖2是其GC/MS-MS圖，該樣品中同時(shí)檢出MI和CMI，含量分別為1.95、3.51 mg/kg。

3 結(jié)論

建立了1個(gè)GC/MS-MS方法，對皮革及其制品中7種限用異噻唑啉酮類抗菌劑進(jìn)行了同時(shí)測定。該方法利用超聲萃取技術(shù)提取待測樣品中的限用異噻唑啉酮類抗菌劑，提取物經(jīng)固相萃取柱凈化后進(jìn)行GC/MS-MS分析，外標(biāo)法定量。該方法定量下限低至0.05～0.10 mg/kg，遠(yuǎn)低于相關(guān)法規(guī)的限量要求，可完全滿足皮革及其制品中限用異噻唑啉酮類抗菌劑含量的日常檢測工作需要。采用該方法對市售皮革樣品進(jìn)行測試，結(jié)果在部分樣品中檢出異噻唑啉酮抗菌劑。