陳海蘭，盧黎明，郭海霞，高 宇，薛 晶

1.中國人民解放軍第九八一醫(yī)院腎臟內(nèi)分泌科，河北承德 067000；2.中國人民解放軍第九八一醫(yī)院衛(wèi)勤處，河北承德 067000;3.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北承德 067000；4.河北省承德醫(yī)學(xué)院形態(tài)實驗中心，河北承德 067000

糖尿病屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)高發(fā)疾病，具有慢性進展性，糖尿病的產(chǎn)生由多環(huán)境、多因素共同導(dǎo)致。我國糖尿病患者發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害患者生命健康。糖尿病患者機體代謝系統(tǒng)受到損傷，從而進一步導(dǎo)致多種疾病產(chǎn)生，其中腎臟首先受到損傷，主要表現(xiàn)在腎臟功能衰退，對降糖物質(zhì)的排泄減少，且導(dǎo)致藥物在機體停留時間增加，腎臟負(fù)擔(dān)加重。目前，藥物是治療糖尿病疾病的主要方式，但是治愈難度大，因此了解其發(fā)病機制及尋找有效藥物對于改善糖尿病患者生存及預(yù)后具有重要幫助[1]。近年來，中藥因其藥源廣泛性在治療糖尿病中逐漸受到重視。地黃是玄參科植物，生物活性廣泛，具有清熱、涼血、補血等功能。地黃寡糖(ROS)為地黃主要成分，現(xiàn)代藥物學(xué)發(fā)現(xiàn)ROS具有增加機體免疫，改善內(nèi)分泌功能及抗自由氧等作用。糖尿病的產(chǎn)生及發(fā)展與血管增生具有重要關(guān)聯(lián)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)生物活性廣泛，在多種病理組織中發(fā)揮不同作用[2]。但是目前關(guān)于ROS對糖尿病中VEGF的影響研究較少，因此，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，觀察ROS對血脂代謝及腎臟組織中VEGF的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 40只SPF級SD大鼠，雌雄各半，購自常州卡文斯動物實驗，平均體質(zhì)量0.10～0.15 kg，在常溫下進行無菌飲食2周，按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗。

1.2藥品與試劑 二甲雙胍(批號：020413)購自正安醫(yī)藥集團有限公司；兔抗人VEGF抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自上海佰世凱生物化學(xué)科技有限公司；甲醛、乙醇購自泰州華宇醫(yī)療器械有限公司。

1.3方法

1.3.1分組及糖尿病大鼠建模 40只SPF級大鼠按照隨機數(shù)字表法分為健康組、DM組、ROS組及藥物對照組，每組10只，雌雄各半。DM組、ROS組及藥物對照組大鼠均建立糖尿病模型。 糖尿病模型通過高脂飼料聯(lián)合STZ建立。高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料、豬油、蔗糖、蛋白占比分別為68%、10%、20%、2%。飼養(yǎng)60 d后空腹15 h后注射STZ(30 mg/kg)，連續(xù)7 d檢測血糖值，血糖≥16.7 mmol/L則建模成功，進行下一步實驗。

1.3.2干預(yù)方法 建模7 d后，ROS組采用ROS灌胃，藥物對照組采用二甲雙胍灌胃，健康組及DM組采用生理鹽水灌胃，劑量均為200 mg/(kg·d)，干預(yù)時間均為22 d。

1.3.3血脂代謝指標(biāo)檢測 采集大鼠空腹靜脈血2 mL于EP管中，4 000 r/min離心后保留血清，采用生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)水平。

1.3.4腎臟重量檢測 血脂代謝指標(biāo)檢測結(jié)束后，采用頸部脫臼方法處死大鼠，分離腎臟，采用電子天秤稱重，計算方法：腎臟指數(shù)=[器官重量(g)/動物體質(zhì)量(g)]×1 000。

1.3.5HE染色進行腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 實驗結(jié)束后，將腎臟采用甲醛固定，石蠟包埋，進行4 μm切片，乙醇脫水，封片，染色，置于200倍顯微鏡下觀察腎小球間質(zhì)等病理結(jié)構(gòu)，其余腎臟組織置于低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6免疫組織化學(xué)(免疫組化)檢測腎臟組織VEGF陽性表達情況 腎臟組織采用10%的甲醛固定，切片，脫蠟，脫水，置于37.5 ℃ 0.5 h后加入1%的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，血清封閉0.5 h，加入一抗，4 ℃過夜，加入兔抗人VEGF抗體，加入二抗0.5 h后，復(fù)染，封閉。陽性細(xì)胞為淡黃色至棕褐色，顯微鏡觀察選取200倍下20個視野，計算細(xì)胞陽性率。

1.3.7Western blot檢測VEGF蛋白相對表達量 腎臟組織加入胰蛋白裂解液，離心后取上清液加入樣孔，進行電泳，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡10 min，反復(fù)用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，每次5 min，分別加入兔抗人VEGF，GAPDH抗體(1∶500)、過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)，分別雜交，PBS沖洗。后將PVDF膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖像。

2 結(jié) 果

2.1ROS對各組大鼠血脂代謝指標(biāo)的影響 與健康組比較，DM組、ROS組、藥物對照組血脂指標(biāo)TC、TG升高，HDL-C降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物干預(yù)后，ROS組、藥物對照組TC、TG明顯低于DM組，HDL-C明顯高于DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且ROS組TG明顯低于藥物對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 ROS對各組大鼠血脂代謝指標(biāo)的影響

2.2ROS對各組大鼠腎臟重量及指數(shù)的影響 與健康組比較，DM組、ROS組、藥物對照組大鼠腎臟重量及腎臟指數(shù)均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；藥物干預(yù)后，與DM組比較，ROS組及藥物對照組腎臟重量及腎臟指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ROS組與藥物對照組上述指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 ROS對各組大鼠腎臟重量及指數(shù)的影響

2.3ROS對各組大鼠腎臟組織的影響 健康組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整，腎小球基質(zhì)分布清晰，未見增生及肥大；DM組大鼠腎小球基質(zhì)模糊，毛細(xì)血管增厚，炎性反應(yīng)浸潤嚴(yán)重，腎小球出現(xiàn)肥大；經(jīng)藥物干預(yù)的ROS組及藥物對照組上述病理情況均好轉(zhuǎn)，癥狀減輕。見圖1。

2.4免疫組化檢測腎臟組織中VEGF陽性表達 健康組、DM組、ROS組及藥物對照組大鼠腎臟組織中VEGF陽性表達率分別為(15.49±2.09)%、(34.30±5.40)%、(20.39±3.02)%、(21.04±3.15)%，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.530，P<0.05)。DM組VEGF陽性表達率明顯高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.290，P<0.001)。ROS組及藥物對照組VEGF陽性表達率明顯低于DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.125、6.723，P<0.001)，但ROS組及藥物對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.471，P=0.643)。見圖2。

圖1 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.5Western blot檢測腎臟組織VEGF蛋白表達情況 健康組、DM組、ROS組及藥物對照組大鼠腎臟組織中VEGF蛋白相對表達量分別為1.00±0.15、3.03±0.33、1.45±0.27、1.50±0.30，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=109.100，P<0.001)。DM組VEGF蛋白相對表達量明顯高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.880，P<0.001)。ROS組及藥物對照組VEGF蛋白相對表達量明顯低于DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.870、10.990，P<0.001)。ROS組及藥物對照組VEGF蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.392，P=0.699)。見圖3。

圖2 各組大鼠腎臟組織VEGF陽性表達情況

圖3 各組大鼠腎臟組織VEGF蛋白表達情況

3 討 論

糖尿病是全球高發(fā)內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，且30%的患者會累及其他器官，并發(fā)癥發(fā)生率最高的機體器官是腎臟。隨著糖尿病疾病的發(fā)生、發(fā)展，機體腎臟代謝平衡遭到破壞，持續(xù)高血糖、血脂會提高血液黏稠度，增加微血管疾病的發(fā)生，最終導(dǎo)致糖尿病腎病。中藥在臨床疾病的治療中具有重要作用，地黃作為治療糖尿病傳統(tǒng)藥物之一，歷史悠久，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，灌胃ROS，觀察其對糖尿病的療效。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將糖尿病歸屬到消渴范疇，首見于《內(nèi)經(jīng)》體系，理論逐漸完善于唐宋，歷代醫(yī)家對消渴論述較為豐富。隋朝《諸病源候論》提及“腎虛腎燥則渴，不能傳致水液，故隨飲小便”，表示糖尿病與腎臟密切相關(guān)。地黃為治療糖尿病疾病的傳統(tǒng)藥物，具有內(nèi)熱消渴，涼血清熱等功效[3]。ROS是中藥傳統(tǒng)地黃的主要成分，能夠有效治療糖尿病疾病，改善血脂代謝紊亂，主要通過降低肝糖異常分泌，進而降低TC、TG。糖尿病患者臨床表現(xiàn)為血脂代謝及水失衡，血漿中TC、TG明顯升高，HDL-C降低，表明機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)遭到破壞。而ROS能夠改善糖尿病大鼠血脂代謝紊亂，是通過改善胰島素抵抗而改善血脂、血糖代謝。二甲雙胍為常見糖尿病用藥，但是與ROS比較，ROS能夠有效改善血脂代謝失衡，降血糖作用較溫和，二甲雙胍降血脂同時能誘發(fā)TG升高，導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與DM組比較，ROS組及藥物對照組大鼠血脂代謝指標(biāo)均出現(xiàn)改善，ROS與二甲雙胍比較，對血脂改善效果更佳。

糖尿病患者腎臟是最早受到損傷的器官，持續(xù)高糖可能改變腎臟微環(huán)境，增加腎臟排泄負(fù)擔(dān)，加重腎臟損傷，導(dǎo)致腎臟增生、肥大，而腎臟重量是直接反映腎臟肥大的主要指標(biāo)，準(zhǔn)確度較高[4]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠建模成功后，腎臟重量增加，這與腎臟功能損傷關(guān)系密切。從現(xiàn)代藥物學(xué)角度來講，ROS能夠通過改善血管內(nèi)皮通透性，從而減少糖尿病大鼠腎臟中有害物質(zhì)，多環(huán)節(jié)、多信號共同作用降低大鼠腎臟重量，改善毛細(xì)血管增厚情況，降低腎小球濾過率，避免出現(xiàn)腎臟肥大[5]。本研究結(jié)果顯示，ROS組及藥物對照組腎臟重量均明顯低于DM組，說明ROS能夠通過降低糖尿病大鼠腎臟重量而改善病情。

VRGF分泌合成主要靠腎臟完成，是一種特異度較高的血管內(nèi)皮生長因子。在健康人機體中其表達減少，在糖尿病患者機體內(nèi)表達升高，其主要原因是糖尿病患者機體內(nèi)外氧氣交換不足導(dǎo)致機體處于缺氧狀態(tài)，激活VEGF表達。以往研究顯示，VEGF能夠加快血管新生，提高內(nèi)皮細(xì)胞生物活性，加快糖尿病腎臟發(fā)生、發(fā)展[6]。此外，VEGF升高時能夠在細(xì)胞膜中形成特定通道，提高血管內(nèi)外通透性，加快多種大分子物質(zhì)穿過，增加腎臟負(fù)擔(dān)，加重糖尿病腎病病情。VEGF能夠通過分泌大量細(xì)胞因子增加腎小球基質(zhì)厚度，進一步增強炎性反應(yīng)，惡化病情。而以地黃為主要成分的ROS藥物能抑制糖尿病大鼠血管重建，改善血瘀[2]。糖尿病腎病大鼠存在血運不暢，傷及脈絡(luò)，可加快機體微環(huán)境紊亂。ROS具有抑制VEGF表達，在缺氧疾病中能夠明顯降低VEGF?？祩サ萚7]研究表示，地黃具有降低惡性腎炎中VEGF水平，改善血管炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，ROS與二甲雙胍均能夠降低糖尿病大鼠腎臟組織中VEGF，與DM組差異較大，說明ROS能夠通過抑制VEGF表達而改善糖尿病病情，加快好轉(zhuǎn)。

綜上所述，灌胃ROS能夠改善糖尿病大鼠血脂代謝指標(biāo)，降低腎臟重量，這可能與抑制VEGF表達具有一定的關(guān)系。