米衛(wèi)國(guó),張 偉,劉建軍,張昭鵬

陜西省漢中市中心醫(yī)院胸外科，陜西漢中 723000

肺癌是世界上最常見的癌癥之一，也是癌癥致死的主要原因，5年生存率僅為10%～20%[1-2]，嚴(yán)重影響人類生命健康。然而，用于治療和預(yù)防肺癌的傳統(tǒng)化療往往伴隨不良反應(yīng)和耐藥性發(fā)生。因此，發(fā)掘出一種成本低、不良反應(yīng)小、易于獲得的新的治療藥物意義重大[3]。傳統(tǒng)中藥含有豐富的生物活性成分，通過靶向與疾病相關(guān)的多種分子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用。因此，傳統(tǒng)中藥是可以開發(fā)用于預(yù)防和治療癌癥的潛在候選藥物。土貝母是一種傳統(tǒng)中草藥，又名假貝母、地苦膽、草貝，為葫蘆科土貝母屬植物的干燥塊莖。性味苦、微寒，歸肺、脾經(jīng)，有散結(jié)、消腫、解毒之功能，原載于清代趙氏所編《本草綱目拾遺》，曾用于乳癰、瘰疬、乳腺炎等。近年來，有研究報(bào)道，土貝母具有一定的抗腫瘤作用[4]，但既往研究都只局限于針其單體化合物活性的評(píng)價(jià)。本研究從土貝母提取物整體著手，通過制備土貝母含藥血清，進(jìn)一步深入評(píng)價(jià)傳統(tǒng)中草藥土貝母對(duì)肺癌的抗腫瘤活性，為指導(dǎo)臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 土貝母購(gòu)自老百姓大藥房連鎖股份有限公司；雄性SD大鼠(SPF級(jí))60只，體質(zhì)量(200±10)g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0007]；人肺癌A549和H1299細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；Gibco胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；DMEM-高糖型細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，雙抗(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶[含乙二胺四乙酸(EDTA)]購(gòu)自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；兔抗裂解型胱天蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)抗體、兔抗Cleaved-Caspase-8、兔抗Cleaved-Caspase-9、兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體均購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology公司；細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的DMEM-高糖型培養(yǎng)液，于CO2濃度為5%、溫度為37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞，待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)藥物的提取 取中藥材土貝母置于中藥煎鍋中，加入4倍量水常溫浸泡30 min，再加熱至沸騰，煎煮30 min，過濾收集濾液。濾渣再次加入2倍量水，加熱至沸騰，煎煮30 min，稍冷后趁熱過濾，收集下層濾液。濾渣再次加入2倍量水，加熱至沸騰，再次煎煮30 min，稍冷后趁熱過濾，棄去濾渣，收集濾液，合并2次濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液，最終獲得相當(dāng)于含土貝母生藥材質(zhì)量濃度為1.5 g/mL的水煎液，分裝并密閉保存于-20 ℃冰箱備用[4]。

1.2.3土貝母含藥血清的制備 將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為土貝母組和正常對(duì)照組，各10只，灌胃給藥前各組大鼠禁食、不禁飲18 h，按照8 g/kg生藥劑量給予大鼠灌胃，正常對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水。每日分早、晚2次給藥，間隔時(shí)間為10 h，連續(xù)灌胃給藥3 d，正常飲食、飲水。在第4天第1次大鼠灌胃土貝母提取液1 h后，麻醉大鼠，剖開腹部，在腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置0.5 h，在5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上層血清，即得土貝母水煎液含藥血清。同組大鼠含藥血清合并混勻，在56 ℃水浴條件下滅活30 min。采用0.22 μm無菌微孔濾膜，在無菌條件下進(jìn)行過濾，收集濾液，無菌封裝，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，采用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后使用。

1.2.4MTT法檢測(cè)土貝母含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖的影響 消化、收集人肺癌A549和H1299細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板中，分為11組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移去細(xì)胞培養(yǎng)液，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次。對(duì)照組細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)液，給藥組細(xì)胞更換含有2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、40.0%含藥血清的培養(yǎng)液，以相應(yīng)濃度的無藥血清(10%血清)作為陰性對(duì)照組。將96孔板置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。每孔加入濃度為5 mg/mL的無菌MTT溶液20 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h，棄去每孔上清液，再依次每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液200 μL，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度(A)值，計(jì)算每組細(xì)胞A值的平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用下列公式計(jì)算相對(duì)增殖率。細(xì)胞相對(duì)增殖率(%)=(A給藥組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.2.5土貝母含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞Ki67表達(dá)水平的影響 采用免疫熒光方法檢測(cè)土貝母含藥血清處理人肺癌細(xì)胞中Ki67相對(duì)表達(dá)量的變化。消化、收集人肺癌A549和H1299細(xì)胞，接種于無菌24孔板中(含有細(xì)胞爬片)，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，更換含有10% 土貝母含藥血清的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，以相應(yīng)濃度的無藥血清(10%血清)作為陰性對(duì)照組，各組細(xì)胞繼續(xù)孵育24 h。次日，棄去上清液，用PBS漂洗3次，棄去PBS，室溫下用4%多聚甲醛固定10 min。PBS漂洗3次去除多余甲醛。每孔加入0.05% 的Triton X-100溶液400 μL，室溫條件下孵育30 min，用PBS漂洗3次后，棄去PBS。每孔滴加山羊血清封閉液300 μL，室溫孵育30 min后，棄去封閉液，不洗，每孔細(xì)胞爬片上滴加稀釋的Ki67抗體(1∶1 000)，放入濕盒，37 ℃條件下孵育1 h。采用PBST洗3次，每次3 min。再滴加熒光二抗于各組細(xì)胞爬片上，室溫避光條件下孵育30 min。避光條件下用PBST洗3次，每次5 min，再加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液，室溫避光條件下孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。避光下從24孔板中取出各組細(xì)胞爬片，用抗熒光淬滅封片劑避光條件下封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)Ki67相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)土貝母含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)MTT試驗(yàn)結(jié)果，選用5.0%和10.0%濃度的土貝母含藥血清處理肺癌細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌細(xì)胞凋亡情況。消化、收集人肺癌A549和H1299細(xì)胞，接種于6孔板中，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去每孔培養(yǎng)液并用無菌PBS漂洗3次。分別加入新的含有濃度為5.0%和10.0%土貝母含藥血清的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，以相應(yīng)濃度的無藥血清作為陰性對(duì)照組。24 h后消化收集各組細(xì)胞，各組細(xì)胞用PBS漂洗3次，每組樣品用195 μL的Annexin V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)結(jié)合緩沖液(10 mmol/L HEPES/NaOH,140 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L CaCl2)重懸細(xì)胞。各組樣本中加入濃度為25 μg/mL的Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液5 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。離心5 min，收集細(xì)胞沉淀并加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。再加入10 μL的碘化丙錠(PI)溶液(250 μg/mL)輕輕混勻。立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7Western blot試驗(yàn)檢測(cè)土貝母含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 消化、收集人肺癌A549和H1299細(xì)胞，接種于直徑為10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔，加入細(xì)胞培養(yǎng)液10 mL在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。次日，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，分別加入新的含有濃度為5.0%和10.0%土貝母含藥血清的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，以相應(yīng)濃度的無藥血清作為陰性對(duì)照組。24 h后消化收集各組細(xì)胞，每組細(xì)胞樣本在冰浴中加入蛋白裂解液200 μL，裂解30 min。在4 ℃低溫13 000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心20 min，收集上清液、棄去沉淀，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。各組以40 μg蛋白量上樣，在6 %濃縮膠、12%分離膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。采用10%脫脂奶粉封閉2 h，按照常規(guī)滴加一抗(Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9、Bax、Bcl-2、β-actin，1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，室溫復(fù)溫2 h，PBST洗膜3次，每次5 min。然后加入羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。PBST洗膜3次。采用化學(xué)發(fā)光方法，通過凝膠化學(xué)發(fā)光儀拍照，灰度掃描，以β-actin為內(nèi)參。結(jié)果以β-actin比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)土貝母含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞中Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響。

2 結(jié) 果

2.1土貝母含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，土貝母含藥血清明顯抑制人肺癌A549和H1299細(xì)胞的增殖，并呈一定劑量依賴性。與對(duì)照組比較，5.0%、10.0%、20.0%、40.0%的土貝母含藥血清對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率分別為(10.65±2.56)%、(20.22±2.55)%、(28.48±2.49)%和(32.72±3.35)%，對(duì)H1299細(xì)胞增殖抑制率分別為(9.51±2.51)%、(16.05±2.63)%、(26.67±3.90)%和(30.87±4.71)%，土貝母含藥血清對(duì)人肺癌A549和H1299細(xì)胞增殖抑制作用明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2土貝母含藥血清處理人肺癌A549和H1299細(xì)胞Ki67相對(duì)陽性表達(dá)率 給予人肺癌細(xì)胞土貝母含藥血清處理后，人肺癌細(xì)胞中Ki67的陽性表達(dá)率明顯下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

注：A為肺癌細(xì)胞中Ki67免疫熒光染色；B為Ki67相對(duì)表達(dá)率。與對(duì)照組比較，*P<0.05；NS表示與對(duì)照組比較，P>0.05。

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞凋亡率的半定量分析；B為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌H1299細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞凋亡率的半定量分析。與對(duì)照組比較，*P<0.05；NS表示與對(duì)照組比較，P>0.05。

注：A為Western blot試驗(yàn)檢測(cè)人肺癌A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；B為蛋白表達(dá)半定量分析。與對(duì)照組比較，*P<0.05,NS表示與對(duì)照組比較，P>0.05。

2.3土貝母含藥血清誘導(dǎo)人肺癌A549和H1299細(xì)胞的凋亡 與對(duì)照組比較，土貝母含藥血清處理細(xì)胞24 h后肺癌細(xì)胞凋亡率明顯升高。其中5.0%的土貝母含藥血清處理后，人肺癌A549和H1299細(xì)胞凋亡率分別為(9.23±0.70)%和(10.50±1.21)%，10.0%的土貝母含藥血清處理后，人肺癌A549和H1299細(xì)胞凋亡率分別為(15.57±1.20)%和(18.83±2.12)%，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4土貝母含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，不同濃度土貝母含藥血清處理細(xì)胞后，肺癌細(xì)胞中Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9及Bax的表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2表達(dá)水平明顯下降，對(duì)Cleaved-Caspase-8表達(dá)無影響。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、4。

注：A為Western blot法檢測(cè)人肺癌H1299細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；B為蛋白表達(dá)半定量分析。與對(duì)照組比較，*P<0.05；NS表示與對(duì)照組比較，P>0.05。

3 討 論

肺癌是全球常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和致死率居高不下，并呈逐年上升及年輕化趨勢(shì)。目前，臨床治療肺癌常見方法仍然以手術(shù)聯(lián)合放療和化療為主，但是肺癌對(duì)傳統(tǒng)化療藥物有強(qiáng)抗藥性，化療有效率低，并且通常還伴有一系列并發(fā)癥和嚴(yán)重不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者免疫功能下降、身體衰弱、炎性反應(yīng)等[6]，嚴(yán)重影響肺癌患者治療后的生活質(zhì)量。

中藥治療癌癥作為我國(guó)獨(dú)特的治療方式，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，從整體辨證施治而形成。能充分體現(xiàn)出在腫瘤治療中的個(gè)性化、多靶點(diǎn)、多層次治療原則[7-8]，且其低毒、有效、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，在臨床治療多種疾病中療效明顯[9]。中醫(yī)認(rèn)為，肺癌是由于邪愈盛而正愈虛，本虛標(biāo)實(shí)，病變錯(cuò)綜復(fù)雜，病勢(shì)日益深重。肺癌之本虛以陰虛、氣陰兩虛多見，標(biāo)實(shí)以氣阻、瘀血、痰濁多見，以致癌毒內(nèi)積。土貝母性味苦、微寒、歸肺、脾經(jīng)，有散結(jié)、消腫、解毒之功能，近年來研究表明，其單體化學(xué)成分有明顯的抗腫瘤活性[5]。而中藥中單體化學(xué)成分不能完全代表其在體內(nèi)發(fā)揮作用的有效物質(zhì)形式[10]。因此，中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法為中藥藥理學(xué)的體外研究提供了可行性，能夠反映中藥在體內(nèi)發(fā)揮的藥效作用，明確其作用機(jī)制[11]。

本研究采用不同濃度土貝母含藥血清處理人肺癌A549和H1299細(xì)胞，MTT結(jié)果表明，土貝母含藥血清對(duì)人肺癌A549和H1299細(xì)胞增殖呈現(xiàn)一定劑量依賴性的抑制作用。Ki67是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)陽性率相對(duì)越高，提示細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，土貝母含藥血清處理的人肺癌細(xì)胞中Ki67蛋白水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明土貝母含藥血清對(duì)人肺癌A549和H1299細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人肺癌A549和H1299細(xì)胞給予土貝母含藥血清處理后，肺癌細(xì)胞凋亡率顯著升高(圖2)，提示土貝母含藥血清可誘導(dǎo)人肺癌A549和H1299細(xì)胞的凋亡。增殖的不可控和抗凋亡是腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展過程中的重要特征，細(xì)胞凋亡途徑主要有線粒體和死亡受體發(fā)生的凋亡，Caspase家族成員在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[12]。Caspase-3是其重要成員之一，是細(xì)胞凋亡的“執(zhí)行者”，其受Caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞死亡受體途徑和Caspase-9介導(dǎo)的細(xì)胞線粒體途徑的細(xì)胞凋亡過程[13]。因此，為進(jìn)一步探討土貝母水提物含藥血清誘導(dǎo)人肺癌A549和H1299細(xì)胞的凋亡的可能作用機(jī)制，本研究采用Western blot試驗(yàn)檢測(cè)給予土貝母水提物含藥血清處理的人肺癌A549和H1299細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果表明，土貝母水提物含藥血清處理的肺癌細(xì)胞中Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，并顯著增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，對(duì)Cleaved-Caspase-8表達(dá)無顯著影響。結(jié)果表明，土貝母水提物含藥血清可能通過影響人肺癌細(xì)胞中Caspase介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用。

本研究探討了土貝母水提物含藥血清誘導(dǎo)肺胃癌細(xì)胞凋亡的作用，初步探討其可能的作用機(jī)制，結(jié)果表明土貝母水提物含藥血清體外抗肺癌作用顯著，其可能是通過影響人肺癌細(xì)胞中Caspase介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果為土貝母是否可作為治療肺癌的進(jìn)一步深入研究和指導(dǎo)臨床用藥提供了新思路。