張奡,曾碧珊，郭維文,陳河梅

(廣東省第二中醫(yī)院腎病科，廣東 廣州 510095)

腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是終末期腎衰竭患者的主要治療方法之一，因操作簡(jiǎn)單，價(jià)格親民而有著更廣闊的推廣前景。但長(zhǎng)期腹膜透析會(huì)引起腹膜的形態(tài)和功能改變，腹膜纖維化(peritoneal fibrosis，PF)的發(fā)生，是病人退出腹膜透析的主要原因之一，且無(wú)有效的解決辦法。盡管腹膜間皮細(xì)胞的間皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變是導(dǎo)致腹膜纖維化的關(guān)鍵過(guò)程，但生物不相容的腹膜透析液是導(dǎo)致改變間皮細(xì)胞功能和增殖的原因，這些過(guò)程的基礎(chǔ)仍然不清楚[1]。腹膜纖維化有兩個(gè)因素，即纖維化過(guò)程本身和炎癥。這兩個(gè)因素之間的聯(lián)系通常是雙向的，每個(gè)過(guò)程都相互誘導(dǎo)[2]。因此，探討腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的發(fā)生機(jī)制、從而尋找有效的治療措施，是目前需要解決的一個(gè)問(wèn)題。很多中藥單藥成分或中藥復(fù)方制劑在改善腹膜纖維化方面獲得了一定的療效。

本研究通過(guò)觀察芍藥苷(paeoniflorin，PF)對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞的影響，評(píng)價(jià)其防治腹膜纖維化的效果，為防治腹膜纖維化提供新的中藥治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

人腹膜間皮細(xì)胞(HMrSV5)(由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科腎臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。

1.2 主要試劑與藥物

芍藥苷，由成都瑞芬思生物科技有限公司提供，批號(hào)：s-010-17021；低鈣腹膜透析液(42.5 g/L乳酸鹽-G)，由百特醫(yī)療用品有限公司提供，批號(hào)：20023568。DMEM/F12 培養(yǎng)基：Gibco，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)；胎牛血清：Cellmax，賽澳美細(xì)胞技術(shù)(北京)有限公司，中國(guó)；胰蛋白酶：Gibco，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)；青霉素/鏈霉素：Gibco，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)；PBS pH7.2basic(1×)： Life Technologies,Thermo Fisher Scientific,美國(guó) ；10×細(xì)胞裂解液：cell signaling technology,美國(guó); 蛋白酶/磷酸酶抑制劑：cell signaling technology，美國(guó); PVDF 膜：Millipore，美國(guó); 麗春紅：Sigmar-Aldrich，美國(guó);α-SMA：Sigmar-Aldrich，美國(guó)；CTGF: Arigo Biolaboratories,中國(guó)；二抗：HRP 標(biāo)記羊抗兔 IgG、HRP 標(biāo)記羊抗鼠 IgG：Cell Signaling Technology，美國(guó)；化學(xué)發(fā)光液：Millipore，美國(guó)；DAPI：Sigmar-Aldrich，美國(guó)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及方法

使用永生人HMrSV5細(xì)胞株，分為空白組、高糖組、芍藥苷低劑量組、芍藥苷中劑量組、芍藥苷高劑量組，每天換液。37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-70%融合后加入刺激。其中高糖組加入4.25%腹膜透析液，芍藥苷低劑量組加入4.25%腹膜透析液及芍藥苷50 μg/mL、芍藥苷中劑量組加入4.25%腹膜透析液及芍藥苷100 μg/mL、芍藥苷高劑量組加入4.25%腹膜透析液及芍藥苷200 μg/mL。

1.4 Western Blot檢測(cè)各組蛋白的表達(dá)

細(xì)胞在同步培養(yǎng)后加入刺激，24h后提取蛋白。使用裂解液裂解蛋白裂解細(xì)胞后，采用BCA法測(cè)蛋白濃度，依據(jù)所測(cè)濃度，用細(xì)胞裂解液配成統(tǒng)一濃度的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，初始電壓為90V，待溴酚藍(lán)至分離膠時(shí)加大電壓至110V。PVDF膜恒壓100 mV轉(zhuǎn)膜。一抗 4 ℃孵育過(guò)夜。 洗膜后室溫下孵育二抗60 min。 化學(xué)發(fā)光液 A:B 液按 1∶1 比例混合。洗好的PVDF 膜浸入發(fā)光液中 60 s，后置于凝膠成像及化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)，選擇自動(dòng)曝光模式連續(xù)曝光，選擇、保存最佳效果的圖像保存。應(yīng)用計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值定量，以目的蛋白及內(nèi)參蛋白條帶灰度比值表示目的蛋白的相對(duì)含量。

1.5 免疫熒光法觀察相關(guān)蛋白的變化

在24孔板內(nèi)放置玻片，種細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞爬片約50%左右加入刺激劑，24 h后染片。4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100室溫透膜。山羊血清，室溫封閉。一抗孵育4 ℃過(guò)夜。熒光二抗室溫孵育1 h。DAPI染核，避光封片，避光室溫風(fēng)干后 4℃保存。然后在激光共聚焦顯微鏡觀察采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對(duì)α-SMA和CTGF蛋白表達(dá)的影響

在給予高糖及不同濃度芍藥苷刺激后，α-SMA和CTGF表達(dá)的蛋白條帶如圖1所示。將其灰度值與內(nèi)參蛋白的比值比如圖2所示。高糖組的α-SMA的表達(dá)高于空白組、芍藥苷低劑量組、芍藥苷中劑量組和芍藥苷高劑量組(P<0.05)。芍藥苷高劑量組α-SMA的表達(dá)低于芍藥苷中劑量組和芍藥苷低劑量(P<0.05)。芍藥苷高劑量組各組間隨濃度增加α-SMA的表達(dá)逐漸減少(P<0.05)。高糖組CTGF的表達(dá)與空白組、芍藥苷高劑量組有顯著差異(P<0.05)，與芍藥苷中劑量組和芍藥苷低劑量無(wú)顯著差異(P>0.05)?？瞻捉M與芍藥苷中劑量組和芍藥苷低劑量有顯著差異(P>0.05)，與芍藥苷高劑量組無(wú)顯著差異(P<0.05)。

2.2 免疫熒光法中α-SMA在各組的表達(dá)情況

間接免疫熒光顯示空白組α-SMA表達(dá)較少，高糖組α-SMA 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，芍藥苷組隨濃度增加α-SMA的表達(dá)逐漸減少。

圖1 Western blot(A)；腹膜間皮細(xì)胞CTGF(B)和α-SMA(C)的表達(dá)

圖2 免疫熒光法中α-SMA在各組的表達(dá)情況(綠色表示α-SMA，藍(lán)色為細(xì)胞核)

3 討論

腹膜纖維化(PF)在各種臨床情況下都是一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，但是驅(qū)動(dòng)其發(fā)生的機(jī)制尚待完全確定。已知結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞活性，它誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、新生血管發(fā)生，與纖維化發(fā)生密切相關(guān)。Li及Sakai,N.等的研究表明抑制CTGF的表達(dá)后，可進(jìn)一步抑制成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞的積累以及血管新生，從而可以改善腹膜纖維化的進(jìn)展[3-4]。肌纖維母細(xì)胞表面表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA被公認(rèn)為腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化早期的標(biāo)志因子，在許多研究中作為組織纖維化病變進(jìn)展指標(biāo)。

芍藥苷是一種糖苷類(lèi)物質(zhì)，是白芍根中提取的藥效成分單體,是白芍總苷TGP的主要成分。有研究表明芍藥苷可以通過(guò)Smad依賴(lài)性途徑抑制肺纖維化中 TGF-β介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[5]，也可以通過(guò)TGF-β1/ Smads信號(hào)通路對(duì)輻射誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有保護(hù)作用，抗纖維化的功能越來(lái)多的被發(fā)現(xiàn)[6]。還有報(bào)道顯示芍藥苷靶向作用于小鼠血吸蟲(chóng)病，改善纖維化。可以因?yàn)榭估w維化治療似乎使肝臟平均肉芽腫直徑和纖維化面積明顯減少，血清腫瘤壞死因子-α明顯增加[7]。我們?cè)谠缙诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，TGP對(duì)腹膜纖維化大鼠的腹膜通透性有改善，并能一定程度抑制腹膜纖維化的進(jìn)展[8-9]。因此本研究將使用不同濃度的芍藥苷作用于人腹膜間皮細(xì)胞，來(lái)觀察高糖影響下的腹膜間皮細(xì)胞的變化。結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)，隨著芍藥苷濃度的增加，纖維化的相關(guān)指標(biāo)α-SMA和CTGF均有不同程度下降，提示芍藥苷可能通過(guò)下調(diào)α-SMA和CTGF的表達(dá)從而減緩和早期改善腹膜纖維化，進(jìn)而起到腹膜保護(hù)作用。

綜上所述，持續(xù)的高糖和炎癥能促進(jìn)腹膜分泌TGF-β1，造成腹膜纖維化。芍藥苷可減輕其引起的腹膜纖維化，一定程度上保護(hù)腹膜。以上研究為芍藥苷防治腹膜纖維化提供了的理論依據(jù)和方法。