關(guān) 欣，秦 雯，謝百波，臧新鈺，肖坤，張潔

(1.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100094；2.北京慧寶源生物技術(shù)股份有限公司，北京 100000；3.遼寧省撫順市食品檢驗(yàn)檢測中心，遼寧 撫順 113000)

中藥刺五加葉為五加科植物刺五加葉Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根莖或莖，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效。刺五加葉中主要含有皂苷、黃酮以及有機(jī)酸等類化合物,具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤、降血糖等藥理作用。研究表明刺五加葉中的多糖具有較強(qiáng)的自由基清除能力，可作為新型天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)利用。葉恒等建立HPLC同時(shí)定量刺五加葉中原兒茶酸、綠原酸、刺五加苷E、金絲桃苷及槲皮苷五種主要成分的方法。該方法簡便可靠,適用于刺五加葉中的多成分含量測定。目前，隨著對刺五加成分的不斷探索開發(fā)，刺五加作為藥物和保健品的需求逐年增加,但資源逐漸減少，為擴(kuò)充刺五加藥用資源，經(jīng)查發(fā)現(xiàn)刺五加葉中酚類成分有活性，因此本實(shí)驗(yàn)優(yōu)先研究刺五加葉成分，然而，刺五加葉缺乏統(tǒng)一質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)，難以全面反映藥材的整體質(zhì)量。

本文建立刺五加葉一測多評法實(shí)現(xiàn)對刺五加葉5種成分的質(zhì)量控制，即選擇其中使用廣泛的綠原酸，建立其與新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷和槲皮苷間的相對校正因子，計(jì)算出各成分的含量，為刺五加葉質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

一、實(shí)驗(yàn)材料

(一)實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(配紫外光檢測器)，真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，超純水機(jī)(深圳市宏森環(huán)?？萍加邢薰?， SB25-12 DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

(二)實(shí)驗(yàn)試劑

乙腈為色譜純，純凈水(購自娃哈哈集團(tuán)有限公司)，其他試劑均為分析純，其他如表1、表2。

表1 實(shí)驗(yàn)對照品和實(shí)驗(yàn)試劑

表2 實(shí)驗(yàn)藥材

二、方法與結(jié)果

(一)色譜條件

色譜柱為Agilent Elipse Plus C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5μm)；流動(dòng)性為0.3%磷酸水(A)-乙腈溶液(B)梯度洗脫，0～3 min， 95%→95%A；3～40 min， 95%→80%A；40～55 min， 80%→70%A；55～60 min，70%→10%A；體積流量1.0 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫30℃。

(二)溶液制備

1.供試品溶液的制備。將刺五加葉干燥后粉碎，精確稱取刺五加葉粉末1.0 g，精密加入70%甲醇水10 mL，超聲提取40 min，用70%甲醇水補(bǔ)足失重，0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.對照品溶液的制備。精密稱取各對照品適量，加甲醇溶解定容配制成每1 mL含綠原酸0.951 mg、隱綠原酸0.502 mg、新綠原酸0.63 mg、槲皮苷1.12 mg、金絲桃苷1.162 mg的溶液，作為對照品溶液。

3.方法學(xué)考察

(1)專屬性試驗(yàn)。取供試品溶液，采用上述色譜條件進(jìn)樣分析，觀察圖譜，比較各對照品保留時(shí)間，結(jié)果表明該方法專屬性良好，見圖1和圖2。

(2)線性關(guān)系試驗(yàn)。精密稱取各對照品綠原酸9.51 mg、新綠原酸6.3 mg、隱綠原酸5.02 mg、金絲桃苷11.62 mg、槲皮苷1.12 mg，置于10 mL量瓶，用甲醇定容至刻度線，搖勻，配成各對照品儲(chǔ)備液。精密量取各對照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成系列對照品溶液，新綠原酸為0.2，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005 mg/L，綠原酸為0.95，0.8，0.4，0.2，0.1，0.05 mg/L，隱綠原酸為0.2，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005mg/L，金絲桃苷為0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025(mg/L)，槲皮苷為0.08，0.04，0.02，0.01，0.005，0.0025 (mg/L)。按照2.1色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算得到各對照品線性回歸方程，表明在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，考察結(jié)果見表3。

圖1 刺五加葉供試品高效液相色譜圖

圖2 混標(biāo)對照品溶液高效液相色譜圖

表3 對照品線性范圍及線性回歸方程

(3)精密度試驗(yàn)。取上述混合對照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷峰面積的RSD值分別為0.24%、0.03%、0.44%、0.05%、0.16%，結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。將上述供試品溶液放于室溫下0、2、4、8、12、24 h，根據(jù)上述色譜條件檢測其峰面積，考察24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性。24 h內(nèi)5種成分峰面積的RSD值分別為新綠原酸2.35%、綠原酸0.72%、隱綠原酸2.06%、金絲桃苷0.58%、槲皮苷0.52%(n=6)，表明試驗(yàn)溶液在本實(shí)驗(yàn)條件下具有良好的穩(wěn)定性。

(5)重復(fù)性試驗(yàn)。制備6份供試品溶液進(jìn)樣分析，得到各成分的峰面積，計(jì)算得到5種目標(biāo)成分的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷和槲皮苷峰面積的RSD值分別為1.77%、2.02%、2.78%、1.75%、1.30%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

(6)加樣回收率試驗(yàn)。按上述方法制備9份供試品溶液，分別加入樣品中5種成分質(zhì)量的低(80%)、中(100%)、高(120%)濃度已知對照品，根據(jù)上述色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算加樣回收率及RSD值。結(jié)果表明，加入的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷5種成分質(zhì)量的平均回收率，在低濃度時(shí)分別為95.3%、96.2%、97.7%、97.9%、95.8%，RSD值分別為0.8%、1.4%、3.8%、0.5%、1.6%；在中濃度時(shí)分別為95.0%、95.6%、103.6%、103.5%、104.6%，RSD值分別為2.5%、2.7%、3.0%、1.7%、1.9%；在高濃度時(shí)分別為96.3%、97.9%、96.8%、95.6%、95.4%，RSD值分別為1.3%、5.3%、3.7%、2.3%、0.9%。

(7)定量下限、檢測下限。用50%甲醇水稀釋混合對照品，根據(jù)上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣檢測6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在最低定量限檢測中，當(dāng)新綠原酸濃度為0.004mg/mL時(shí)信噪比為9.91，當(dāng)綠原酸濃度為0.004mg/mL時(shí)信噪比為12.35，當(dāng)隱綠原酸濃度為0.004mg/mL時(shí)信噪比為9.62，當(dāng)金絲桃苷濃度為0.008mg/mL時(shí)信噪比為6.23，當(dāng)槲皮苷濃度為0.015mg/mL時(shí)信噪比為11.82。在最低檢測限檢測中，當(dāng)新綠原酸濃度為0.0008mg/mL時(shí)信噪比為3.40，當(dāng)綠原酸濃度為0.0008mg/mL時(shí)信噪比為2.21，當(dāng)隱綠原酸濃度為0.0008mg/mL時(shí)信噪比為3.12，當(dāng)金絲桃苷濃度為0.0003mg/mL時(shí)信噪比為2.87，當(dāng)槲皮苷濃度為0.0005mg/mL時(shí)信噪比為3.60。

4.相對校正因子的確定。根據(jù)上述方法制備6份混合對照品溶液，并根據(jù)上述色譜條件確定5種成分的峰面積。使用綠原酸作為內(nèi)參物，計(jì)算新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷槲皮苷的相對校正因子分別為0.906、0.899、3.136、2.645。

5.一測多評法與外標(biāo)法結(jié)果比較。制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定，用兩種方法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表4。其中，編號1～6批刺五加葉產(chǎn)地依次為遼寧省新賓(刺五加葉)、遼寧省清原(刺五加葉)、黑龍江省雞西(刺五加老粗葉)、黑龍江省雞西(刺五加嫩葉)、黑龍江省雞西(刺五加葉1)、黑龍江省雞西(刺五加葉2)。分析結(jié)果認(rèn)為2種含量測定方法得到的含量之間無顯著性差異，說明一測多評法用于刺五加葉中多種酚類成分的含量測定中可行。

表4 外標(biāo)法和一測多評法測定刺五加葉中5種成分含量(mg/g)

三、討論

(一)波長的選擇

實(shí)驗(yàn)嘗試不同的檢測波長，發(fā)現(xiàn)在360 nm檢測波長下，測定成分的分離度良好，峰形較好，雜質(zhì)峰較少，確保方法的準(zhǔn)確度較高。

(二)提取方法的考察

實(shí)驗(yàn)嘗試甲醇、70%甲醇水、50%甲醇水提取刺五加葉。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用70%甲醇水超聲提取刺五加葉時(shí)，目標(biāo)成分提取率較高，分離度較好，雜質(zhì)峰較少。而且具有易操作、節(jié)省時(shí)間、成本的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)建立一測多評法測定刺五加葉中五種酚類成分的含量，為刺五加葉的質(zhì)量評價(jià)和質(zhì)量控制提供參考。