謝紅丹(綜述)， 曹 聰(審校)

肝吸蟲病主要受華支睪吸蟲或麝貓后睪吸蟲感染所致。華支睪吸蟲多在中國、越南、韓國流行，廣東、廣西、黑龍江是我國主要流行地區(qū)；而麝貓后睪吸蟲多見于東南亞國家[1]。我國感染者與患者人數(shù)大概有1 500萬，約11億人存在感染風(fēng)險。因此，華支睪吸蟲病已成為我國現(xiàn)如今最嚴(yán)重的食源性寄生蟲病[2-3]。其病理學(xué)基礎(chǔ)主要是機械性損傷、排泄-分泌代謝產(chǎn)物(excretory-secretory products,ESPs)產(chǎn)生的免疫炎癥改變、進(jìn)行性膽管周圍纖維化及膽管上皮細(xì)胞的增生。膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma,CCA)是肝吸蟲感染導(dǎo)致的最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病率在原發(fā)性肝癌病理分型中位居第二，疾病特征為早期缺乏臨床癥狀、病情快速進(jìn)展且病死率高[4]。因此，2012年，華支睪吸蟲被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)國際癌癥研究署正式列為CCA的Ⅰ類致癌物[5]。肝吸蟲感染和CCA之間的致病聯(lián)系包括由吸蟲的取食和遷移活動引起膽管上皮的機械性損傷、感染相關(guān)炎癥引起的免疫病理學(xué)改變及其ESPs的直接影響，這些機制共同導(dǎo)致膽管上皮增生和腺瘤性改變，繼而膽管上皮細(xì)胞逐漸向惡性轉(zhuǎn)化[6]。近年來有許多學(xué)者對肝吸蟲感染的致癌機制做了相應(yīng)的臨床及實驗研究，但至今其致癌機制尚未明晰。本文就肝吸蟲引發(fā)CCA的發(fā)病機制作一綜述。

1 機械性損傷

當(dāng)內(nèi)含肝吸蟲囊蚴的生/半生的淡水魚被人攝食進(jìn)入十二指腸后，囊蚴與胰蛋白酶接觸并排出幼蟲，隨后幼蟲經(jīng)膽汁趨化性快速遷移到肝內(nèi)膽管，并逐漸發(fā)育為成蟲。蟲體移動、ESPs及其免疫病理改變可使膽管上皮損傷。隨著蟲體體積增大及數(shù)量增多，膽管上皮損傷漸進(jìn)性加重，致使膽道壁變厚、膽道狹窄、膽道內(nèi)壓增加，而后膽管上皮逐漸形成潰瘍。蟲卵從潰瘍口進(jìn)入膽管周圍組織后，許多炎癥細(xì)胞浸潤并逐步發(fā)展為嗜酸性肉芽腫性炎，致使膽管周圍纖維化。研究[7]發(fā)現(xiàn)，華支睪吸蟲感染組家兔肝內(nèi)膽管明顯增粗，鏡下見匯管區(qū)增大并有膠原成分積聚，肝內(nèi)膽管增粗、膽管壁增厚，膽管及周圍組織炎癥，膽管內(nèi)皮局部可見低級到高級的上皮內(nèi)瘤變。長期華支睪吸蟲感染引起的機械損傷與慢性炎癥反應(yīng)致使的膽管上皮病理性增生是膽管上皮癌前病變和腺瘤樣改變的標(biāo)志[8]。此外，肝吸蟲長期寄生于宿主的外周膽管中，引起膽管和周圍肝組織的病理變化，包括炎癥、黏膜中產(chǎn)生黏蛋白的細(xì)胞化生、進(jìn)行性膽管周圍纖維化和上皮細(xì)胞增生，尤其是肝吸蟲機械和化學(xué)刺激引起的膽管上皮持續(xù)性損傷和炎癥反應(yīng)，有助于肝吸蟲相關(guān)性CCA的發(fā)生[9]。

2 肝吸蟲ESPs的作用

肝吸蟲將ESPs的成分通過體表排泄口排出并滲入膽管上皮和肝臟組織，形成一種ESPs微環(huán)境，這在宿主與寄生蟲的相互作用中產(chǎn)生重要的影響。在ESPs微環(huán)境下的細(xì)胞呈現(xiàn)出多種病理改變，如氧化還原失調(diào)、增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)[10-11]。研究者通過分析經(jīng)ESPs處理的人CCA細(xì)胞系(human cholangiocarcinoma cell line,HuCCT1)的差異轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)，被調(diào)控的基因或蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、癌變、代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)，這表明ESPs在宿主細(xì)胞的病理改變過程中起著多重作用[12]。華支睪吸蟲ESPs的成分中一些已鑒定的蛋白質(zhì)，如解毒酶、肌紅蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制劑、哺乳動物生長因子的同源物和抗凋亡蛋白，具有高度的免疫原性，在人類宿主中具有同源物[13]。重組麝貓后睪吸蟲ESPs的蛋白質(zhì)如硫氧還蛋白、顆粒樣生長因子被人膽管細(xì)胞內(nèi)化，并調(diào)節(jié)與凋亡信號、傷口愈合和癌癥途徑相關(guān)的基因/蛋白表達(dá)，這說明了ESPs的蛋白質(zhì)成分可能在肝吸蟲相關(guān)CCA的致病機理中起著至關(guān)重要的作用[14]。據(jù)報道[15]，源于華支睪吸蟲的ESPs誘導(dǎo)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶募集和微小染色體維持蛋白7的反式激活，可能通過組蛋白乙?；揎椄淖冎掳┌谢虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞向CCA細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，肝吸蟲產(chǎn)生的ESPs還能推動CCA細(xì)胞的遷移和侵襲，這是導(dǎo)致CCA進(jìn)展至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。Pak等[16]的研究表明，ESPs依賴性基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9的活性增強與核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、NF-κB-α抑制蛋白(inhibitor of NF-κB-α,IκB-α)的活性誘導(dǎo)可能有助于CCA的進(jìn)展，在慢性華支睪吸蟲病相關(guān)肝膽損害的情況下，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2-NF-κB-MMP-9信號通路的組成性失調(diào)或許可以促使正常膽管細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)而獲得如CCA細(xì)胞等更具侵襲性的表型。據(jù)報道[17]，經(jīng)ESPs處理的HuCCT1細(xì)胞能促使其三維侵入相鄰的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，同時增加了局灶性黏附蛋白和金屬蛋白酶的表達(dá)水平，表明ESPs可能改變CCA細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM黏附特性，ESPs的刺激通過促進(jìn)局部黏附形成和增強ECM降解能力，促進(jìn)了HuCCT1細(xì)胞的侵襲。Kim等[18]的研究表明，華支睪吸蟲的ESPs在體外誘導(dǎo)環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)-2表達(dá)，促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖及其細(xì)胞周期從S向G2/M轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細(xì)胞表型變化，抵消小白菊內(nèi)酯的抗癌作用。在CCA細(xì)胞與膽管細(xì)胞共培養(yǎng)的更為復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中，由于膽管細(xì)胞、CCA細(xì)胞和華支睪吸蟲ESPs之間的協(xié)調(diào)相互作用，梯度電刺激可促進(jìn)HuCCT1細(xì)胞侵襲正常膽管細(xì)胞形成膽管板，并以濃度依賴的方式形成 Ⅰ 型膠原基質(zhì)，這導(dǎo)致了暴露于ESPs的細(xì)胞中白介素(interleukin,IL)-6和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1的分泌增加，并引起細(xì)胞鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)了更具侵襲性的CCA細(xì)胞表型[10，19]。

3 免疫炎癥反應(yīng)

3.1細(xì)胞因子的產(chǎn)生 在肝吸蟲感染過程中，膽管上皮細(xì)胞持續(xù)被刺激后產(chǎn)生細(xì)胞因子參與免疫炎癥反應(yīng)[19]。細(xì)胞因子識別并結(jié)合膜受體后啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，致使免疫細(xì)胞活化、細(xì)胞增殖、遷移、分化與凋亡。炎性細(xì)胞因子通常分為促炎性：IL-12、IL-1、IL-15、IL-4、IL-17、IL-6、IL-23、干擾素(interferon，IFN)-α、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α，以及抗炎性：IL-10、TGF-β[20]。肝吸蟲感染可依次激活不同宿主細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[13，21]。促炎性細(xì)胞因子的增加可能促使膽管上皮與周圍肝組織的免疫炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致更嚴(yán)重的慢性肝膽損傷甚至CCA的發(fā)展[21]。研究[22]表明，華支睪吸蟲感染引起的肝損傷和炎癥反應(yīng)，激活了IFN-α1、IL-2、IL-1b及TGF-β2等細(xì)胞因子的表達(dá)，持續(xù)提高了免疫網(wǎng)絡(luò)分泌的呈時間依賴性的IL-3和IL-6濃度。IL-6作為一種重要的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，其參與人體對病原微生物的天然免疫反應(yīng)和慢性炎癥反應(yīng)，在各種炎癥性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著不可或缺的作用。血循環(huán)中IL-6水平的升高顯著增加了麝貓后睪吸蟲感染引起的膽管周圍纖維化及CCA的風(fēng)險，IL-6可能在慢性致病過程中通過創(chuàng)造一個刺激膽管纖維沉積和癌變的持續(xù)性炎癥環(huán)境發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。一項體外實驗[24]證明，IL-6和TGF-β1參與了CCA炎癥條件下的串?dāng)_，CCA細(xì)胞通過Smad家族蛋白(SMAD family member,Smad)4功能從促進(jìn)細(xì)胞凋亡向增強惡性轉(zhuǎn)變，獲得侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變等惡性特征。IL-17a可經(jīng)過刺激血管形成、集聚中性粒細(xì)胞促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。Su等[25]研究表明，IL-17a在腫瘤內(nèi)或癌旁組織中的表達(dá)在肝吸蟲感染的CCA患者中明顯高于無肝吸蟲感染的CCA患者，IL-17a的上調(diào)與肝吸蟲感染有關(guān)，提示肝吸蟲感染本身是CCA發(fā)展的危險因素，肝吸蟲感染引起的炎癥反應(yīng)有助于CCA的發(fā)展。

3.2細(xì)胞因子的失調(diào) 盡管炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生是宿主抵抗感染或損傷的一種防御機制，但在慢性華支睪吸蟲病相關(guān)肝膽系統(tǒng)異常的情況下，這些多效性細(xì)胞因子的持續(xù)和失調(diào)的產(chǎn)生被認(rèn)為是促發(fā)性的，它們調(diào)節(jié)抗腫瘤反應(yīng)和誘導(dǎo)惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化，炎性細(xì)胞因子的組成性失調(diào)可能會增強膽管及其周圍肝組織中更具侵襲性的病理過程，從而導(dǎo)致CCA的發(fā)生[13，21]。例如，TNF-α最初被認(rèn)為是引起腫瘤壞死的一個相對高濃度因子，它在慢性和中度水平上的活性可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。對于分泌的IL-1β，低濃度的IL-1β誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)并激活保護(hù)性免疫，而高濃度的IL-1β誘導(dǎo)廣泛炎癥反應(yīng)并伴有組織損傷和惡性細(xì)胞侵襲性增加。IL-1β和TNF-α的組成性失調(diào)的產(chǎn)生歸因于炎癥相關(guān)的組織損傷以及隨后的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[13]。在華支睪吸蟲感染小鼠模型中[21]，血循環(huán)TNF-α和IL-6濃度的峰值出現(xiàn)時間分別為感染后1周和2周，而IL-1β的峰值出現(xiàn)時間為感染后8周，這意味著在華支睪吸蟲感染期間，促炎細(xì)胞因子的表達(dá)可能受到免疫反應(yīng)的差異調(diào)節(jié)。研究[26-27]證明，華支睪吸蟲感染小鼠的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)/IL-17分泌性T細(xì)胞(IL-17-secreting helper T cells,Th17)升高，提示Treg與Th17比值的異?？赡軐θA支睪吸蟲病引起肝纖維化的進(jìn)展產(chǎn)生重要的影響，一旦Treg與Th17之間的平衡被破壞，炎癥細(xì)胞的數(shù)量就會減少，膠原沉積會隨著感染的發(fā)展而急劇增加。

3.3氧化自由基的產(chǎn)生 肝吸蟲感染引起的慢性炎癥會產(chǎn)生大量能破壞細(xì)胞生物分子的氧化自由基，如活性氧(reactive oxygen species,ROS)、活性氮(reactive nitrogen species,RNS)，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物的形成，發(fā)生突變、遺傳不穩(wěn)定、表觀遺傳變化和基因表達(dá)的改變[28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)，用ESPs處理的人CCA細(xì)胞，可以激活COX、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthetase,iNOS)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)、NADPH氧化酶[nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH) oxidase,NOX]及脂氧合酶，并呈時間依賴性，從而引發(fā)自由基的增加。據(jù)報道[12]，ESPs介導(dǎo)了ROS的產(chǎn)生，這表明在華支睪吸蟲ESPs的反應(yīng)中產(chǎn)生的ROS導(dǎo)致了HuCCT1細(xì)胞中硫氧還蛋白和過氧還蛋白亞型等抗氧化蛋白的表達(dá)升高，而肝吸蟲通過線粒體膜去極化引起大鼠嗜酸細(xì)胞凋亡。這意味著來自肝吸蟲的ESPs觸發(fā)了自由基的產(chǎn)生，這些自由基與宿主細(xì)胞的初始病理生理反應(yīng)有關(guān)。在暴露于華支睪吸蟲ESPs的HuCCT1細(xì)胞中，由NOX、XO和iNOS活化產(chǎn)生的自由基參與了NF-κB的活化，自由基的增加顯著促進(jìn)胞漿降解IκB-α及NF-κB亞基RelA與p50的核易位，并增加了NF-κB共有DNA結(jié)合活性，這表明酶促產(chǎn)生的自由基是宿主NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵觸發(fā)因子[11]。氧化損傷產(chǎn)物通過iNOS誘導(dǎo)局部一氧化氮生成，并積聚在膽管周圍的慢性炎癥部位。膽管上皮細(xì)胞一直處于高濃度的氧化損傷環(huán)境中，致使CCA的發(fā)生和(或)進(jìn)展[30]。在炎癥反應(yīng)中生成多余的自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation,LPO)，致使大量的氧化性DNA損傷和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)。研究[21]表明，華支睪吸蟲感染由于產(chǎn)生LPO而破壞宿主的氧化還原平衡，從而創(chuàng)造了一種促進(jìn)癌癥的微環(huán)境，這有利于華支睪吸蟲相關(guān)CCA的發(fā)生與發(fā)展。宿主細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的破壞以及自由基和Toll樣受體激活之間的內(nèi)源性相互作用的延長加重了膽管上皮和周圍肝組織的慢性炎癥環(huán)境，最終導(dǎo)致更嚴(yán)重的肝膽損害[9]。除了ROS和RNS直接修飾DNA外，LPO產(chǎn)物如反式-4-羥基-2-壬醛、丙二醛以及巴豆醛也能修飾DNA堿基，形成各種外環(huán)加合物，導(dǎo)致細(xì)胞突變以及致癌性損傷。自由基和LPO產(chǎn)物還可以調(diào)節(jié)信號分子，改變參與炎癥和癌變的轉(zhuǎn)錄因子和酶的功能[31]。

4 膽管周圍纖維化

肝吸蟲感染可以導(dǎo)致膽管周圍纖維化，慢性反復(fù)感染或重度感染還能進(jìn)展至肝硬化。在感染早期階段，幼蟲的ESPs刺激膽管上皮增殖，并沿膽道系統(tǒng)觸發(fā)炎癥反應(yīng)；而到感染后期，膽管上皮增生逐漸進(jìn)展為腺體增生和膽管上皮中腺瘤性增生；在重度感染中，膽管周圍纖維化向上延伸至膽管毛細(xì)血管，向下延伸至門脈區(qū)域；長期慢性感染的條件下，一些病例形成的膽管周圍纖維化還能夠發(fā)展成膽汁性肝硬化[10]。這些腺瘤性增生、膽管周圍纖維化或肝硬化的形成最終可導(dǎo)致CCA。長期慢性肝損傷時，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)處于包括氧化應(yīng)激、凋亡體、細(xì)胞因子在內(nèi)的自分泌或旁分泌信號的微環(huán)境中，并轉(zhuǎn)變成活化的肌成纖維細(xì)胞，這在發(fā)生肝纖維化的過程中是一個至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。HSCs的活化可產(chǎn)生細(xì)胞因子及生長因子并導(dǎo)致ECM的生成與積累，從而推動肝纖維化的進(jìn)展[32-34]。研究[35]結(jié)果顯示，華支睪吸蟲溶血磷脂酶A(lysophospholipase A of Clonorchis sinensis,CsLysoPLA)在成蟲及其ESPs引起的機械和化學(xué)損傷后滲透毛細(xì)血管，然后通過蛋白激酶A依賴的B型絲/蘇氨酸蛋白激酶(B-type serine/threonine protein kinase,B-Raf)/ERK1/2途徑上調(diào)巨噬細(xì)胞IL-25激活HSCs，從而促進(jìn)肝纖維化。通過免疫定位分析[36]，CsLysoPLA定位于實驗感染大鼠肝內(nèi)膽管內(nèi)的腺瘤樣增生組織中，腺瘤樣增生是由膽管細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而成，它和上皮增生共同參與了細(xì)胞增殖介導(dǎo)的CCA的發(fā)生。此外，CsLysoPLA還上調(diào)了HSCs中促纖維化基因的表達(dá)。華支睪吸蟲慢性感染導(dǎo)致的膽管周圍纖維化受到TGF-β/Smad信號通路的密切調(diào)控，隨著感染的發(fā)展，膠原沉積逐漸增加[26]。據(jù)報道[37]，華支睪吸蟲ESPs成分中的分泌型磷脂酶A2還能促使HSCs的增殖與活化，從而參與肝纖維化的形成與發(fā)展。華支睪吸蟲感染小鼠模型的研究結(jié)果顯示，Th2和Treg細(xì)胞亞群的增加可能在肝纖維化的形成中起重要作用[38]。華支睪吸蟲感染誘導(dǎo)的IL-13和ESPs中糖基化T2核糖核酸酶的免疫也可能有利于肝纖維化的發(fā)生[39]。

5 展望

肝吸蟲在我國廣泛分布，有著嚴(yán)重的危害性，CCA的發(fā)生發(fā)展與長期遷延性的肝吸蟲感染有密不可分的聯(lián)系。肝吸蟲感染與CCA致病關(guān)系的相關(guān)研究已經(jīng)持續(xù)了100多年，其致癌機制的研究也取得了重要進(jìn)展，但目前二者的因果關(guān)系仍未十分明確。在這分子生物學(xué)、免疫學(xué)及科學(xué)實驗技術(shù)飛快發(fā)展的時代，各學(xué)科、各領(lǐng)域之間相互影響、相互促進(jìn),因此研究者還可從不同角度進(jìn)一步深入探究肝吸蟲誘發(fā)CCA的分子生物學(xué)及基因組學(xué)機制，這有助于降低肝吸蟲相關(guān)CCA的發(fā)病率和病死率，為其治療、藥物研制等提供相關(guān)科學(xué)理論依據(jù)。