羅 鑫， 沈 寧， 劉 暢， 張 沅， 林麗娜， 李 楓， 李冰瀅， 肖紹文， 陳 芳， 張慶梅

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原發(fā)性肝癌的70%～90%[1]，具有惡性程度高、發(fā)病隱匿、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差和生存率低等特點(diǎn)[2]，急需探索新的HCC治療方法。近年來(lái)，腫瘤免疫治療因其較好的特異性和較小的副作用而備受關(guān)注[3]，但腫瘤免疫治療需要篩選腫瘤特異性抗原。黑色素瘤相關(guān)抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)是一個(gè)多基因的大家族，因其第一個(gè)成員首先在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)而得名，可分為A、B、C、D、E、F等亞家族，其許多成員在多種腫瘤類型中呈特異性高表達(dá)，被視為腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)[4]。MAGE-D4是2001年Sasaki等[5]發(fā)現(xiàn)的一個(gè)MAGE家族成員，與其他許多成員一樣，其基因定位于X染色體，具有MAGE家族共有的同源結(jié)構(gòu)域(MAGE homology domain,MHD)。有研究報(bào)道MAGE-D4在膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、結(jié)直腸癌和口腔癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)[6-11]，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)[5，8]，提示MAGE-D4具有腫瘤特異性，具有進(jìn)一步開發(fā)成腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的潛力。本研究應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，分析HCC中MAGE-D4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并探討其表達(dá)水平與生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，初步評(píng)價(jià)MAGE-D4作為HCC潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取及分析 通過(guò)癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)獲取371例HCC組織和50例正常肝組織的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)。應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘工具UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)分析HCC組織中MAGE-D4 mRNA的表達(dá)，mRNA表達(dá)水平以每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的抄本數(shù)(transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads,TPM)表示。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，以盡可能多地獲取各種不同基因的RNA水平表達(dá)數(shù)據(jù)，最終獲得共56 953個(gè)基因的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)。應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，從這些備選基因中篩選與HCC中MAGE-D4表達(dá)相關(guān)的基因[12]。應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析MAGE-D4表達(dá)與HCC患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性[13]，并繪制Kaplan-Meier生存曲線圖。生存分析以MAGE-D4 mRNA表達(dá)水平的上三位數(shù)為分界值，將HCC患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組；另外按患者人種進(jìn)行分層。

1.2組織標(biāo)本和臨床資料收集 選擇于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年6月至2011年8月經(jīng)手術(shù)獲取的HCC標(biāo)本70例，癌旁組織標(biāo)本30例。HCC患者中男57例，女13例；年齡24～78(48.5±11.2)歲。按Edmondson病理分級(jí)，1級(jí)10例，2級(jí)40例，3級(jí)16例，4級(jí)2例，另有2例分級(jí)不明確。按TNM分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期38例，Ⅳ期9例。所有組織均經(jīng)病理科專家確診。同時(shí)，通過(guò)醫(yī)院病歷系統(tǒng)收集所有標(biāo)本來(lái)源患者的腫瘤直徑、血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)濃度、癌栓和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染等臨床資料。以上組織標(biāo)本和臨床、病理資料的收集均獲患者知情同意，并經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：20130310-1)。

1.3免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)染色與結(jié)果評(píng)判 以10%中性福爾馬林固定組織標(biāo)本，經(jīng)石蠟包埋制成切片后按常規(guī)方法進(jìn)行MAGE-D4染色。免疫組化染色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，MAGE-D4兔抗人多克隆抗體由本課題組制備[14]。采用已知MAGE-D4表達(dá)陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以兔免疫前血清替代一抗作為陰性對(duì)照。染色結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度相加的方法進(jìn)行綜合評(píng)判[15]。陽(yáng)性細(xì)胞百分比積分：0%～5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度積分：無(wú)染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。將二者積分相加，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～5分為陽(yáng)性(++)，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。其中(-)和(+)歸為低表達(dá)組，而(++)和(+++)歸為高表達(dá)組。

2 結(jié)果

2.1HCC組織與正常肝組織的MAGE-D4 mRNA表達(dá)水平比較 對(duì)來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，HCC組織MAGE-D4 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織(P<0.001)。見圖1。

圖1 HCC組織與正常肝組織的MAGE-D4 mRNA表達(dá)水平比較結(jié)果圖

2.2HCC組織中MAGE-D4 mRNA表達(dá)相關(guān)基因的篩選結(jié)果 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，采用Pearson相關(guān)性分析探討HCC組織中與MAGE-D4 mRNA表達(dá)具有相關(guān)性的其他基因，結(jié)果顯示MAGE-D4與AFP的相關(guān)性最高(r=0.556)。與MAGE-D4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的前10個(gè)基因見表1。

表1 HCC組織中MAGE-D4 mRNA表達(dá)相關(guān)基因的篩選結(jié)果

2.3MAGE-D4 mRNA表達(dá)水平與患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 黃種人患者，MAGE-D4 mRNA低表達(dá)組的5年生存率為69.8%，高表達(dá)組的5年生存率為48.8%，低表達(dá)組的生存預(yù)后顯著優(yōu)于高表達(dá)組(P<0.05)。白種人患者，MAGE-D4 mRNA低表達(dá)組的5年生存率為36.6%，高表達(dá)組的5年生存率為45.2%，兩組生存預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由于收集到黑種人HCC患者例數(shù)較少(n=28)故未能單獨(dú)進(jìn)行生存分析。對(duì)全種族人群(黃種人、白種人和黑種人)HCC患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，MAGE-D4 mRNA低表達(dá)組的5年生存率為48.4%，高表達(dá)組的5年生存率為47.3%，兩組生存預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

?全種族人群(n=364)；?黃種人(n=155)；?白種人(n=181)

2.4HCC組織與癌旁組織MAGE-D4蛋白表達(dá)情況比較 MAGE-D4蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，染色程度深淺不一，呈淡黃至棕褐色均質(zhì)或顆粒狀分布。在70例HCC組織中，有34例(48.57%)為MAGE-D4高表達(dá)，36例(51.43%)為低表達(dá)；在30例癌旁組織中，有7例(23.33%)為MAGE-D4高表達(dá)，23例(76.67%)為低表達(dá)，兩組高表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.530，P=0.019)。見圖3。

A1：HCC組織，MAGE-D4(+)；A2：癌旁組織，MAGE-D4(-)；B1：HCC組織，MAGE-D4(+++)；B2：癌旁組織，MAGE-D4(-)；A1與A2為來(lái)源于同一患者的HCC組織和癌旁組織；B1與B2為來(lái)源于同一患者的HCC組織和癌旁組織

2.5MAGE-D4蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 MAGE-D4蛋白高表達(dá)組34例，低表達(dá)組36例。高表達(dá)組HCC患者血清AFP濃度≥400 μg/L的人數(shù)比例顯著大于低表達(dá)組(P<0.05)，但兩組性別、年齡、腫瘤級(jí)別、腫瘤分期、腫瘤直徑、癌栓和HBV感染情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 MAGE-D4蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

續(xù)表2

3 討論

3.1HCC是全球第六大常見的惡性腫瘤和第二大腫瘤致死原因，每年新增發(fā)病例約80萬(wàn)例[16]。我國(guó)是HCC高發(fā)地區(qū)，發(fā)病人數(shù)占全世界的50%以上，發(fā)病率和病死率在所有腫瘤類型中分別排第四位和第三位[17-18]。HCC的危險(xiǎn)因素包括HBV和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)慢性感染、酒精性肝炎以及脂肪性肝炎等[19]。目前，HCC的早期治療以手術(shù)切除和射頻消融為主，而中晚期則使用局部治療聯(lián)合系統(tǒng)治療，但治療效果不理想，中位生存時(shí)間和無(wú)進(jìn)展生存期仍不能讓人滿意[20-21]。

3.2免疫治療是近年來(lái)興起的一種具有廣闊臨床應(yīng)用前景的腫瘤治療策略，其通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤特異性免疫、打破免疫耐受，達(dá)到抑制腫瘤進(jìn)展的目的，目前主要有腫瘤疫苗、過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移(adoptive cell transfer,ACT)療法和免疫檢查點(diǎn)抑制劑三條治療路線，但由于腫瘤特異性抗原的缺乏限制了其開發(fā)與應(yīng)用。目前HCC的免疫治療，如細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)抗體等取得了一定進(jìn)展，更多的HCC免疫治療靶點(diǎn)有待發(fā)現(xiàn)和進(jìn)一步驗(yàn)證[3]。

3.3由于MAGE家族的許多成員具有腫瘤特異性，因此其具有成為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的潛質(zhì)，近年已有一些家族成員，如MAGE-A1和MAGE-A3已作為疫苗靶點(diǎn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)[22-23]。MAGE家族成員MAGE-D4不僅具有腫瘤特異性[5-11]，近年來(lái)也有研究證實(shí)其具有較強(qiáng)的免疫原性，可引起機(jī)體強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，在以MAGE-D4抗原為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗研究中也初步展現(xiàn)出一定的效果[9，24-27]。因此，MAGE-D4有進(jìn)一步開發(fā)成腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的潛力，應(yīng)用前景廣闊。但迄今為止，學(xué)者們對(duì)MAGE-D4與HCC的關(guān)聯(lián)性研究仍較少[11]，本文就此進(jìn)行了研究。本研究結(jié)果顯示，HCC組織中MAGE-D4 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織，這與Takami等[11]的研究報(bào)道相似。另外，進(jìn)一步的IHC法檢測(cè)結(jié)果也顯示，HCC組織中MAGE-D4蛋白呈高表達(dá)。

3.4蛋白的定位與其在組織細(xì)胞中所發(fā)揮的生物學(xué)功能密切相關(guān)。Ito等[15]報(bào)道MAGE-D4與細(xì)胞骨架微絲共定位于細(xì)胞質(zhì)，在有絲分裂末期至后期，MAGE-D4蛋白與微管蛋白共定位于紡錘體和中心體，提示MAGE-D4可能參與了細(xì)胞分裂活動(dòng)。而Chong等[28]報(bào)道MAGE-D4蛋白主要定位于口腔鱗狀上皮癌的癌細(xì)胞質(zhì)，偶見于細(xì)胞膜。本研究結(jié)果顯示，HCC中MAGE-D4蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，這和Takami等[11]的報(bào)道有異同，相同之處在于均發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞質(zhì)中存在MAGE-D4蛋白，而不同之處在于其并未在HCC細(xì)胞核中檢測(cè)到MAGE-D4蛋白，但發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞膜中存在MAGE-D4蛋白，造成這種不一致的原因可能與不同的腫瘤標(biāo)本和腫瘤的異質(zhì)性表達(dá)等因素有關(guān)。此外，MAGE-D4蛋白在腫瘤細(xì)胞分布的多樣化可能與其在不同腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同功能有關(guān)。MAGE-D4在HCC中發(fā)揮的確切生物學(xué)功能，有待進(jìn)一步的研究。

3.5AFP與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其在HCC的輔助診斷及療效監(jiān)測(cè)中具有重要價(jià)值[29-30]?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，AFP與MAGE-D4的相關(guān)性最高，呈正相關(guān)(r=0.556,P=0.000)，這在本課題組收集的臨床標(biāo)本中也得到進(jìn)一步驗(yàn)證，與Takami等[11]的研究結(jié)果相似。提示MAGE-D4在HCC中可能與AFP協(xié)同參與了HCC的發(fā)生和進(jìn)展。另外，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示對(duì)于總體HCC患者，MAGE-D4 mRNA的表達(dá)水平與生存預(yù)后關(guān)聯(lián)性不顯著，但經(jīng)進(jìn)一步分層分析結(jié)果顯示，MAGE-D4 mRNA高表達(dá)與黃種人HCC患者不良預(yù)后有關(guān)，但與白種人HCC患者生存預(yù)后不顯著。這提示MAGE-D4 mRNA表達(dá)對(duì)HCC患者生存預(yù)后的影響可能具有人種差異，其對(duì)于黃種人更具臨床價(jià)值和意義。

綜上所述，MAGE-D4具有成為HCC免疫治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物的潛力，但其在HCC發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。