李世姣 張曉軍 喬麟軼 賈舉慶 常利芳 張樹偉 暢志堅(jiān) 李 欣

(1山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030800)

土壤鹽漬化是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因素之一。目前全球遭受鹽害的耕地超過8 億hm2，其中我國鹽漬土面積達(dá)1 億hm2[1-2]。隨著糧食需求的不斷加大，增強(qiáng)作物對鹽漬土壤的耐受性進(jìn)而提高其產(chǎn)量，對于保障糧食安全意義重大。小麥(Triticum aestirumL.)是世界上種植面積最廣的糧食作物，廣泛發(fā)掘小麥耐鹽基因、培育耐鹽新品種是充分利用鹽漬化土壤的有效途徑。

隸屬AP2/ERF 超家族的乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factor，ERF)在植物應(yīng)對鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[3]。模式作物擬南芥中，除ERF 以外，AP2/ERF 超家族還包括干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(dehydration responsive element binding，DREB)、 PETALA2 蛋 白(PETALA2，AP2)、與ABI3 和VP1 相關(guān)蛋白[(related to ABA-insentive3(ABI3)/viviparous1，RAV]和單獨(dú)亞族(Soloist)[3]等4 個(gè)家族。其中，ERF 和DREB 家族序列相似性較高，均包含1 個(gè)AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域，但DREB 第14 和第19 位氨基酸分別是纈氨酸(V)和谷氨酸(E)，而ERF 則是丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)[3]。目前擬南芥ERF 家族成員ERF1[4]和ERF3[5]被證實(shí)可以提高植株耐鹽性。此外，水稻(Oryza sativaL.)OsERF922[6]、大豆(Glycine maxLinn. Merr.)GmERF3[7]和GmERF7[8]、番茄(Solanum lycopersicum)TERF1[9]、JERF3[10]和SlERF5[11]、甘蔗(Saccharum officinarum)SodERF3[12]、煙草(Nicotiana tabacumL.)NtTOE3[13]等10 余個(gè)鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)ERF基因已被鑒定。

目前小麥中共有8 個(gè)ERF基因被鑒定[14-17]，其中有3 個(gè)基因與鹽脅迫相關(guān):TaERF1 在小麥?zhǔn)茺}脅迫后表達(dá)水平上調(diào)，過表達(dá)TaERF1 的擬南芥植株耐鹽性增強(qiáng)[14]；TaERF3 過表達(dá)的小麥植株耐鹽性增強(qiáng)，病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)干擾植株則表現(xiàn)為鹽敏感[15]；而TaERF4 過表達(dá)的擬南芥植株對鹽脅迫的敏感性增強(qiáng)[16]。其他鹽脅迫相關(guān)ERF基因的報(bào)道還鮮見。本研究從普通小麥全基因組中分離了ERF 家族，通過系統(tǒng)發(fā)育分析和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析推測可能與鹽脅迫相關(guān)的ERF 成員，并進(jìn)行NaCl 處理下的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ( real time quantitative PCR，RT-qPCR)驗(yàn)證，以期發(fā)掘新的小麥耐鹽基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

耐鹽小麥材料CH7034(由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院暢志堅(jiān)研究員選育)和鹽敏感品種SY95-71[18]用于鹽脅迫處理及RT-qPCR 試驗(yàn)。CH7034 種子萌發(fā)后的胚芽鞘以及幼苗的根、莖、葉用于基因組織表達(dá)水平分析。

1.2 鹽脅迫處理

將小麥種子用1%的雙氧水消毒后放置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)，待胚根伸長至2～3 cm 時(shí)，選擇長勢一致的種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中的1/2 霍格蘭氏營養(yǎng)液中生長，參數(shù)設(shè)置為16 h 光照/8 h 黑暗，24℃/16℃；待幼苗生長至兩葉一心期時(shí)更換含250 mmol·L-1NaCl 的營養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫，在0、6 和12 h 時(shí)剪取幼苗根，于-80℃保存，用于RT-qPCR 分析。按上述方法萌發(fā)小麥CH7034，在芽期和苗期分別取胚芽鞘和根、莖、葉，于-80℃保存，用于基因組織表達(dá)水平分析。

1.3 序列分離與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用AP2/ERF 超家族的隱馬爾可夫模型文件(注冊號:PF00847.20)在nhmmer 軟件[19]中檢索普通小麥品種中國春IWGSCv1.0 注釋蛋白序列(下載自URGI 數(shù)據(jù)庫，http:/ /wheat-urgi.versailles.inra.fr/)，設(shè)置E≤1e-5，獲得小麥AP2/ERF 序列，將其與109 個(gè)擬南芥ERF 家族成員在Clustal X 軟件[20]中進(jìn)行序列多重比對，并用MEGA 6.0 軟件[21]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)聚類結(jié)果以及特征序列分離出小麥ERF 家族。根據(jù)NCBI 注冊號下載19 個(gè)已克隆鹽脅迫相關(guān)ERF基因的編碼蛋白序列，將其與小麥ERF 序列在MEGA 6.0 中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 基因表達(dá)譜與啟動子元件分析

小麥耐鹽品種Arg 和鹽敏感品種Moghan3 受NaCl 脅迫12 h 后的根部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[22](注冊號:SRP158842)下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)，利用tophat2 將reads 比對到參考基因組IWGSCv1.0 上，并利用cufflinks 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝[23]，之后利用edger[24]獲得基因序列的FPKM(expression fragment per kilobase of exon model per million mapped reads)值。從中檢索并篩選表達(dá)量差異顯著的TaERF 序列，篩選標(biāo)準(zhǔn)為:多重假設(shè)檢驗(yàn)(FDR)值小于0.01、且｜log2(FPKM[t-t0]/FPKMCK[t-t0])｜≥1。所得結(jié)果用MeV tool (http:/ /www.tm4.org/mev.html)輸出。

利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)ERF基因起始密碼子前2 000 bp 的基因組序列進(jìn)行啟動子元件分析。

1.5 RT-qPCR

用RNA 提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)提取樣品的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(英杰生命科技有限公司)將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTqPCR 在羅氏LightCycler ? 96-PCR 儀上進(jìn)行，使用的酶為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，內(nèi)參基因?yàn)樾←淭ubulin，所用引物列于表1。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次，所得結(jié)果采用2-ΔΔCT法[25]進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaERF 家族的分離

利用隱馬爾可夫模型文件檢索小麥品種中國春數(shù)據(jù)庫得到559 條AP2/ERF 序列，將其與擬南芥AtERF家族進(jìn)行聚類，共分為7 個(gè)組(圖1-A)，其中有5 個(gè)組(組1～3，組6，組7)包含AtERF成員，從上述5 個(gè)組中進(jìn)一步篩選結(jié)構(gòu)域第14 和第19 位分別為丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)的序列，獲得229 條小麥ERFs(圖1-B)，在小麥A、B、D 基因組中的數(shù)目為70、78 和81，在第1 至第7 同源群分布數(shù)目依次為36、45、20、30、34、39 和25 (圖1-C)。通過分析A/B/D 同源關(guān)系將其歸為96 個(gè)TaERF成員。

2.2 TaERF 與已知耐鹽相關(guān)ERF 的聚類分析

對96 個(gè)TaERF成員與19 個(gè)已報(bào)道耐鹽相關(guān)ERF編碼的蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，有5 個(gè)TaERF成員與耐鹽相關(guān)ERF聚在同一支中(圖2)。其中，TaERF88 和TaERF27 分別是已報(bào)道的TaERF1[14]和TaERF3[15]；而TaERF76、TaERF35 和TaERF85 則分別是擬南芥AtERF3[5]、 水 稻OsERF922[6]和簇毛麥(Haynaldia villosa)DvERF[26]的同源基因。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

2.3 數(shù)據(jù)庫中TaERFs 對鹽脅迫的響應(yīng)

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，TaERF家族中有9 個(gè)成員(共18 個(gè)ERF 序列)在小麥耐鹽品種受鹽脅迫后的表達(dá)水平變化顯著，而在鹽敏感品種中變化不顯著(圖3)。其中，TaERF38 在受NaCl 脅迫12 h后表達(dá)量下調(diào)，其余8 個(gè)成員TaERF3、TaERF27、TaERF28、TaERF55、TaERF56、TaERF64、TaERF67 和TaERF68 在受脅迫后表達(dá)量均上調(diào)。

2.4 TaERFs 受鹽脅迫誘導(dǎo)

基于上述分析結(jié)果，與已克隆耐鹽ERF基因序列相似性高、或受NaCl 誘導(dǎo)的TaERF成員共有13 個(gè)。利用250 mmol·L-1NaCl 對小麥耐鹽材料CH7034 和鹽敏感材料SY95-71 的兩葉一心期植株進(jìn)行鹽脅迫處理，驗(yàn)證這13 個(gè)成員在根部的表達(dá)量變化。RTqPCR 結(jié)果顯示(圖4)，TaERF27、TaERF35、TaERF55和TaERF64 共4 個(gè)基因在耐鹽材料中受NaCl 脅迫后顯著上調(diào)，而在鹽敏感材料中無明顯變化，可能為鹽脅迫響應(yīng)基因。

2.5 鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)TaERF 的組織表達(dá)水平和啟動子調(diào)控元件分析

上述4 個(gè)鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)成員的序列信息列于表2。其中，TaERF27、TaERF35 和TaERF64 無內(nèi)含子，只含有1 個(gè)外顯子，而TaERF55 含有2 個(gè)外顯子。

表2 鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)TaERF 成員信息Table 2 Information of TaERF members related salinity response

圖1 基于聚類結(jié)果和結(jié)構(gòu)特征從小麥AP2/ERF 超家族中分離ERF 家族Fig.1 Isolation of ERF family from wheat AP2/ERF superfamily based on clustering results and sequence characteristics

對鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)成員TaERF27、TaERF35、TaERF55、TaERF64 在耐鹽材料CH7034 萌發(fā)和幼苗階段不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析(圖5)，結(jié)果顯示，上述4 個(gè)成員在苗期根和葉中具有較高的表達(dá)水平，而在胚芽鞘和莖中的表達(dá)量相對較低。其中TaERF35 和TaERF64 分別在苗期根和葉中表達(dá)量最高。

隨后對4 個(gè)成員起始密碼子前2 000 bp 基因組序列內(nèi)包含的調(diào)控元件進(jìn)行分析(圖6)，結(jié)果顯示，上述成員除啟動子元件TATA-box 和增強(qiáng)子區(qū)域調(diào)控元件CAAT-box，還含有參與茉莉酸響應(yīng)的順式元件CGTCA-motif、參與脫落酸響應(yīng)的順式元件ABRE、生長素響應(yīng)元件TGA-element、參與水楊酸響應(yīng)的順式元件TCA-element 以及赤霉素響應(yīng)元件P-box。此外，TaERF27 還含有GARE-motif、AuxRR-core、TATC-box元件，TaERF55 還含有GARE-motif、TATC-box 元件，TaERF64 還含有AuxRR-core 元件。各個(gè)調(diào)節(jié)元件功能見表3。

3 討論

耐鹽基因的發(fā)掘利用是改良小麥品種耐受性，降低土壤鹽害的有效措施。目前小麥中除TaERF1[14]和TaERF3[15]外，還 有HTK[27]、SRO[28]、OPR1[29]和AOC1[30]等幾個(gè)重要耐鹽基因被鑒定。其中，HTK在育種中的應(yīng)用使小麥在鹽堿地上的籽粒產(chǎn)量提高了25%[27]。因此，持續(xù)發(fā)掘耐鹽基因?qū)τ诒Ｕ闲←湼弋a(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。

圖2 TaERF 家族與19 個(gè)已克隆耐鹽ERF 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of TaERF family and nineteen cloned salinity-tolerance ERFs

圖3 耐鹽品種Arg 和鹽敏感品種Moghan3 受NaCl 處理12 h 后表達(dá)水平差異顯著的TaERFsFig.3 The TaERFs expressed significantly differently between salt-tolerant Arg and salt-sensitive Moghan3 after NaCl treatment for 12 hours

圖4 13 個(gè)TaERF 成員在小麥耐鹽材料CH7034 和鹽敏感品種SY95-71 受NaCl 脅迫處理的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of 13 chosen TaERF members in wheat tolerant material CH7034 and sensitive variety SY95-71 after NaCl treatment

圖5 4 個(gè)鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)TaERF 成員在小麥耐鹽材料CH7034 萌發(fā)和幼苗階段不同組織中的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of four TaERF members related salinity response in wheat tolerant material CH7034 at germination and seedling stage

本研究從小麥全基因組中系統(tǒng)地分離了96 個(gè)TaERF家族成員，其中有兩個(gè)是已報(bào)道的TaERF基因。TaERF88 與已報(bào)道的耐鹽基因TaERF1 為同一基因(圖2)，但鹽脅迫處理后TaERF88 在耐鹽品種CH7034 中的表達(dá)水平無明顯變化，推測CH7034 中可能有TaERF88 的一個(gè)新的等位變異，或者受材料遺傳背景的影響，導(dǎo)致表達(dá)水平的變化；TaERF27 是已報(bào)道的耐鹽基因TaERF3，研究表明TaERF3 蛋白可通過GCC-box 順式元件來調(diào)控下游應(yīng)激相關(guān)基因，進(jìn)而提高小麥對鹽和干旱脅迫的適應(yīng)性。本研究通過利用耐鹽材料CH7034 和鹽敏感材料SY95-71 還鑒定出3 個(gè)響應(yīng)NaCl 脅迫的TaERF，分別是TaERF35、TaERF55和TaERF64，為新的耐鹽相關(guān)基因。TaERF55 和TaERF64 在CH7034 中受鹽處理后表達(dá)量上調(diào)，在SY95-71 中則無顯著變化，這與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。TaERF35 是水稻OsERF922 的同源基因，其受鹽脅迫誘導(dǎo)后上調(diào)，而OsERF922 過表達(dá)的植株對鹽的耐受性降低[6]，因此初步猜測TaERF35 在植株抵御鹽脅迫過程中可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，但需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

表3 啟動子元件及其功能Table 3 The function of the promoter element

本研究初步鑒定的4 個(gè)鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)成員TaERF27、TaERF35、TaERF55、TaERF64 在耐鹽材料CH7034 苗期根和葉中均具有較高的表達(dá)水平，此外4個(gè)成員的啟動子區(qū)域(-2 000 bp)，除包含TATA-box、CAAT-box 元件外，還含有脫落酸、水楊酸、茉莉酸、生長素和赤霉素等多種植物激素響應(yīng)元件，這幾種植物激素在植物抗旱[31]、抗寒、耐鹽[32]以及應(yīng)答逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[33-34]等過程中發(fā)揮著重要作用，推測這些成員可能還參與植物多種非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在本研究基礎(chǔ)上，下一步可對TaERF35、TaERF55 和TaERF64 進(jìn)行功能驗(yàn)證，并評估其在生產(chǎn)中的利用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究從小麥全基因組中分離了96 個(gè)TaERF成員，在A、B、D 基因組中共有229 個(gè)拷貝序列；利用RT-qPCR 證 實(shí)TaERF27、TaERF35、TaERF55 和TaERF64 在小麥耐鹽材料CH7034 中受NaCl 脅迫后顯著上調(diào)，而在鹽敏感品種SY95-71 中無明顯變化，推測它們可能為鹽脅迫響應(yīng)基因，其中TaERF27 是已報(bào)道的小麥耐鹽基因TaERF3。這4 個(gè)鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)基因在CH7034 苗期根和葉中均具有較高的表達(dá)水平，此外其啟動子區(qū)域(-2 000 bp)含有脫落酸、水楊酸、茉莉酸、生長素和赤霉素等多種植物激素響應(yīng)元件。本研究為培育小麥耐鹽品種和探索耐鹽分子機(jī)制提供了參考信息。