孫玉燕 張慧青 范 敏 何艷軍 郭平安

(1浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021；2山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000)

西瓜(Citrullus lanatusL.)是葫蘆科一年生蔓性草本植物，在全世界各地均有種植。目前西瓜生產(chǎn)受到黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)的嚴(yán)重威脅。CGMMV 屬于蕪菁花葉病毒科煙草花葉病毒屬，為正單鏈線狀RNA 病毒，病毒粒體為桿狀，大小為300 nm×18 nm[1]。CGMMV 主要侵染西瓜、甜瓜、黃瓜等葫蘆科作物[2]，可通過(guò)種子、花粉、土壤、介體、機(jī)械接觸和水源等多種途徑進(jìn)行傳播[3-4]。自1935年至今，已報(bào)道CGMMV 在全世界30 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有分布[5-7]。近年，CGMMV 傳播速度迅速加快，影響了葫蘆科作物尤其是西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，給商業(yè)育種、育苗培育、種子貿(mào)易、產(chǎn)品生產(chǎn)和零售等行業(yè)帶來(lái)全球性危害[7]。因此，加強(qiáng)CGMMV的防治，提高西瓜對(duì)CGMMV 的抗性是我國(guó)乃至全球西瓜生產(chǎn)亟需解決的重要問(wèn)題。

MiroRNAs(miRNAs)是長(zhǎng)度為19～25 nt 調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源小RNA，2002年首次在植物中被報(bào)道[8]。MiRNAs 可與靶mRNA 的3′-UTR 特異性配對(duì)，引起靶mRNA 的降解或抑制其翻譯，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNAs 在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用[9]。逆境條件下，植物通過(guò)調(diào)控miRNAs 的表達(dá)進(jìn)一步作用于相應(yīng)的靶基因以提高植物對(duì)脅迫的抗性[10]。MIR319 是植物中一類保守的miRNA 家族，主要調(diào)節(jié)靶基因TCP和MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[11]。MIR319 及靶基因可調(diào)節(jié)植物葉片發(fā)育[12]、花器官發(fā)育[13]、次生細(xì)胞壁生物合成[14]、細(xì)胞增殖[15]及根結(jié)發(fā)育[16]等生物學(xué)過(guò)程。

此外，MIR319 及靶基因調(diào)控植物對(duì)生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程。在根結(jié)線蟲(chóng)(root knot nematode，RKN)的脅迫下，番茄miR319/TCP4 調(diào)節(jié)葉片茉莉酸(jasmonic acid，JA)合成基因的表達(dá)和內(nèi)源激素JA 的水平，進(jìn)而調(diào)控對(duì)RKN 的抗性[17]。棉花miR159-MYB、miR319-TCP4 和miR167-ARF8 在RKN 脅迫下的表達(dá)水平表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控，說(shuō)明miRNAs 介導(dǎo)的基因調(diào)控參與棉花對(duì)RKN 的脅迫應(yīng)答[18]。水稻齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus，RRSV)侵染水稻可誘導(dǎo)miR319 的表達(dá)，抑制靶基因TCP2 的表達(dá)，使內(nèi)源激素JA 水平降低，促進(jìn)病毒侵染和癥狀發(fā)展[19]。此外，miR319a可靶向與馬鈴薯Y 病毒(Potato virus Y，PVY)相互作用的下游赤霉素(gibberellin，GA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與GA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[20]。但目前關(guān)于miR319 及靶基因在西瓜CGMMV 脅迫應(yīng)答中的作用尚不明確。

本研究前期通過(guò)對(duì)CGMMV 侵染前后的西瓜材料JJZ-M 進(jìn)行miRNAs 高通量測(cè)序，鑒定獲得了MIR319家族的3 個(gè)成員，miR319、miR319a 及miR319a-3p；其中miR319 在CGMMV 侵染后呈現(xiàn)抑制表達(dá)，而miR319a 在CGMMV 侵染后呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)[21]。為進(jìn)一步明確MIR319 在CGMMV 脅迫應(yīng)答中的作用，本研究從西瓜材料JJZ-M 中分離并克隆MIR319 家族成員的前體基因并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，分析其啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件；對(duì)MIR319 的靶基因及剪切位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，對(duì)靶基因所編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)對(duì)靶基因在CGMMV 不同侵染時(shí)間的表達(dá)進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步了解MIR319 家族成員及靶基因?qū)GMMV 脅迫應(yīng)答的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為西瓜的高代自交系材料JJZ-M，來(lái)源于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。55℃溫湯浸種30 min 后，28℃恒溫箱催芽24 h，待種子露白后播種，在植株兩片真葉期進(jìn)行CGMMV 人工摩擦接種。取保存的發(fā)病葉片和磷酸鹽緩沖液，用研缽研磨成糊狀病毒汁液用于接種。分別于接種0 h(CK)、48 h、25 d 取樣，各取3 株混成一個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行RNA-Seq，RNASeq 為1 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 MIR319 家族前體基因預(yù)測(cè)及分子克隆

利用Blastn(E-value ＝1e-2)將MIR319 家族3 個(gè)成員(miR319、miR319a 及miR319a-3p)的成熟序列與西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /cucurbitgenomics.org/organism/1)進(jìn)行比對(duì)，獲得與MIR319 家族成員成熟序列完全匹配的基因組序列。截取MIR319 兩端150 nt 的核苷酸序列，采用mfold 在線軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析[22]。若其存在完整的莖環(huán)結(jié)構(gòu)且成熟序列完全位于3′或5′端，則預(yù)測(cè)該莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為MIR319 的前體基因Pre-MIR319。

根據(jù)Pre-MIR319 莖環(huán)結(jié)構(gòu)的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物(F: 5′-AGAGCTTTCTTCAGTCCAC-3′；R: 5′-G GAGCTCCCTTCAGTCCAA-3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包含2 μL DNA (50 ng·μL-1)、10 μL 2 × TSINGKE Master Mix、 上游和下游引物(10 μmol·L-1) 各0.5 μL、7 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，33 個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 MIR319 前體基因序列及成熟序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

提取miRbase 22.0 數(shù)據(jù)庫(kù)[23]中35 個(gè)物種的116條miR319 的前體序列，利用MEGA5.1 軟件采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建西瓜Pre-MIR319 與其他物種miR319 前體基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。此外，選取來(lái)自不同物種的成熟miR319 序列，與西瓜MIR319 成熟序列進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.4 MIR319 前體基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

提取西瓜Pre-MIR319 上游1 500 bp 的序列，利用PlantCARE 軟件[24]對(duì)其所包含的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

1.5 MIR319 靶基因預(yù)測(cè)及相關(guān)生物學(xué)分析

根據(jù)前期降解組測(cè)序的結(jié)果(CGMMV 處理前后的葉片混樣，1 個(gè)生物學(xué)重復(fù))，對(duì)MIR319 的靶基因及其靶切割位點(diǎn)進(jìn)行分析。利用ScanProsite 對(duì)靶基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；ProtParam 對(duì)靶基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析；TMHMM 預(yù)測(cè)靶基因編碼的蛋白質(zhì)是否含有跨膜結(jié)構(gòu)域；WolfPSORT 在線軟件對(duì)靶基因的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)及qRT-PCR 分析靶基因在CGMMV 不同侵染階段的表達(dá)

根據(jù)本研究前期RNA-Seq 的結(jié)果，獲得MIR319的靶基因在CGMMV 不同侵染階段(0 h、48 h 和25 d)的表達(dá)，明確MIR319 與靶基因的靶調(diào)控關(guān)系。此外，進(jìn)一步利用qRT-PCR 分析MIR319 靶基因在CGMMV不同侵染階段(0 h、48 h 和25 d) 的表達(dá)。利用FastKing RT Kit [天根生化科技(北京)有限公司]將約2 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以TUA作為內(nèi)參基因。qRT-PCR使用TransStart Top Green qPCR Supermix 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，在StepOne Plus Real-Time PCR System ( Applied Biosystems，美國(guó))中完成。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火15 s，72℃延伸10 s，40 次循環(huán)，3 次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法[25]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。所用引物及序列見(jiàn)表1。

表1 引物及序列Table 1 Primers and sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 MIR319 家族成員鑒定及表達(dá)分析

根據(jù)前期對(duì)CGMMV 侵染前后的西瓜葉片的miRNAs 高通量測(cè)序結(jié)果[21]。在兩個(gè)文庫(kù)中共獲得3個(gè)MIR319 家族成員，miR319、miR319a 及miR319a-3p。其中，在CGMMV 侵染25 d 后miR319 呈現(xiàn)抑制表達(dá)，而miR319a 呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)，miR319a-3p 呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)(表2)，說(shuō)明MIR319 家族成員對(duì)CGMMV 的脅迫呈現(xiàn)不同的響應(yīng)模式。

表2 CGMMV 脅迫下MIR319 家族成員鑒定及表達(dá)分析Table 2 Identification of MIR319 family member and their expression under the CGMMV stress

2.2 MIR319 家族前體基因預(yù)測(cè)及克隆

分別將MIR319 家族的3 個(gè)成員，miR319(TTGGA CTGAAGGGAGCTCC)、miR319a(CTTGGACTGAAGGG AGCTCC)及miR319a-3p(TTGGACTGAAGGGAGCTC CC)的成熟序列與西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /cucurbitgenomics.org/organism/1)進(jìn)行Blast 序列比對(duì)。獲得與miR319 成熟序列完全匹配的4 條基因組序列，包 括 Chr1: 1904345..1904363、 Chr1: 6347848..6347866、Chr5:29773551..29773569 和Chr7:6929678..6929696；獲得與miR319a 成熟序列完全匹配的3 條基因組序列，包括 Chr1: 1904344..1904363、 Chr5:29773551..29773570 及Chr7:6929678..6929697；獲得與miR319a-3p 成熟序列完全匹配的2 條基因組序列，包括Chr1:1904345..1904364 及Chr5:29773550..29773569。其 中 僅Chr1:1904345..1904363 (Chr1:1904344..1904363；Chr1:1904345..1904364)及其上、下游序列(各150 bp)能夠形成完整的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明miR319、miR319a 及miR319a-3p 的成熟miRNA 序列來(lái)源于同一個(gè)前體基因Pre-MIR319。以西瓜基因組DNA 為模板對(duì)Pre-MIR319 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(圖1)。通過(guò)測(cè)序分析，Pre-MIR319 的前體基因長(zhǎng)度為170 bp，可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖1 Pre-MIR319 PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Pre-MIR319

2.3 MIR319 家族成熟序列的比對(duì)及前體基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖2 Pre-MIR319 形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及MIR319 家族成員的成熟序列Fig.2 Stem-loop structures of Pre-MIR319 and mature sequences of MIR319 family member

選取miRbase 22.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中10 個(gè)物種的10 條成熟miR319 序列，與西瓜MIR319 成熟序列進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。序列比對(duì)顯示，MIR319 成熟體序列在5′端第2 ～第14 位以及16 ～20 位堿基具有較高的保守性，而在5′端第1、第15、第21、第22 位堿基存在差異(圖3)。這些堿基差異可能使不同物種的MIR319 成員作用于不同的靶基因，進(jìn)而產(chǎn)生不同的功能。選取miRbase 22.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中35 個(gè)物種的116 條MIR319 前體序列，與西瓜Pre-MIR319 一起通過(guò)MEGA5.1 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，可將這些MIR319 前體序列分為四大分支。第一分支含有36 個(gè)成員，第二分支含有32 個(gè)成員，第三分支含有18 個(gè)成員，第四分支含有30 個(gè)成員，表明MIR319 在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系上存在差異性。其中西瓜Pre-MIR319 位于第一分支，親緣關(guān)系與馬鈴薯 miR319a 的前體基因(MI0025952)最近(圖4)。

2.4 Pre-MIR319 啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

對(duì)Pre-MIR319 上游1 500 bp 啟動(dòng)子區(qū)所含的順式作用元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有多個(gè)順式作用元件(圖5)。包括基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)的順式作用元件(TATA-box 和CAAT-box)、光響應(yīng)元件(TCCC-motif、chs-CMA1a、chs-CMA2a、Ⅰ-box、Box 4、GATA-motif 和GT1-motif)、赤霉素響應(yīng)元件(P-box 和TATC-box)、乙烯響應(yīng)元件(ERE)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCAmotif 和TGACG-motif)、類黃酮生物合成基因調(diào)控元件(MBSI)、分生組織表達(dá)響應(yīng)元件(CAT-box)以及MYB和MYC 等順式作用元件。

圖3 MIR319 成熟序列比對(duì)Fig.3 Alignment of the MIR319 mature sequence

圖4 不同物種MIR319 前體基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic relationship of MIR319 precursor gene sequences for diverse species

2.5 降解組測(cè)序鑒定MIR319 家族成員的靶基因

由表3 可知，降解組測(cè)序?qū)IR319 家族成員的靶基因進(jìn)行鑒定，獲得miR319 及miR319-3p 的4 個(gè)靶基因，分別為Cla002428、Cla013523、Cla019567 和Cla023342，均注釋為TCP轉(zhuǎn)錄因子；獲得miR319a 的2 個(gè)靶基因，Cla013523 及Cla013668，其中Cla013523注釋為TCP轉(zhuǎn)錄因子，Cla013668 注釋為MYB轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步分析MIR319 對(duì)靶基因的剪切位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR319、miR319a 及miR319-3p 剪切靶基因的位點(diǎn)均位于其成熟序列5′端的第10 位堿基。此外，miR319及miR319a - 3p 剪切靶基因的位點(diǎn)分別位于Cla002428、Cla013523、Cla019567 和Cla023342 的第1 067、 731、1 196 和1 085 位堿基；miR319a 剪切靶基因的位點(diǎn)分別位于Cla013523 及Cla013668 的第732及952 位堿基(表3、圖6)。

2.6 靶基因生物信息學(xué)分析

利用ScanProsite 對(duì)靶基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，其中 Cla002428、 Cl013523、 Cla019567 和Cla023342 均含有TCP 結(jié)構(gòu)域，其位置分別位于39 ～97、52 ～110、95 ～153 和44 ～102 位氨基酸，而Cla013668 在33 ～85 位及86 ～140 位氨基酸均含有HTH_MYB 結(jié)構(gòu)域(圖7)。ProtParam 對(duì)靶基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析，靶基因編碼氨基酸數(shù)目為319 ～554 aa、相對(duì)分子量為34.94 ～61.21 kDa、理論等電點(diǎn)為5.29 ～7.80。利用WolfPSORT 在線軟件對(duì)靶基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，其中Cla013523、Cla019567 和Cla013668 定位于細(xì)胞核內(nèi)，Cla002428 和Cla023342 定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，TMHMM 預(yù)測(cè)顯示靶基因編碼的蛋白質(zhì)均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域(表4)。

表3 降解組測(cè)序獲得MIR319 家族成員靶基因Table 3 Target gene of MIR319 family member obtained by degradome sequencing

圖5 Pre-MIR319 啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析Fig.5 Analysis of Pre-MIR319 promoter and its cis-acting regulatory elements

表4 MIR319 靶基因生物信息學(xué)分析Table 4 Bioinformatic analysis of MIR319 target genes

2.7 MIR319 靶基因的表達(dá)分析

根據(jù)CGMMV 侵染前后西瓜葉片的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，對(duì)MIR319 靶基因的表達(dá)進(jìn)行分析。在CGMMV侵染48 h 后Cla002428(TCP)、Cla023342(TCP)及Cla013668(MYB)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)；Cla013523(TCP)及Cla019567(TCP)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。此外，MIR319 所有靶基因在CGMMV 侵染25 d 后均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，其中Cla013523(TCP)及Cla019567(TCP)呈現(xiàn)顯著下調(diào)(表5)。根據(jù)前期miRNA 高通量測(cè)序，MIR319 家族成員(miR319、miR319a 及miR319a-3p)在CGMMV 侵染前后的表達(dá)結(jié)果(表2)，即miR319 及miR319a-3p在CGMMV 侵染25 d 后分別呈現(xiàn)顯著下調(diào)及下調(diào)表達(dá)，而miR319 及miR319a-3p 的靶基因Cla002428(TCP)、 Cla013523 (TCP)、 Cla019567 (TCP) 及Cla023342(TCP)在CGMMV 侵染25 d 后呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；miR319a 在CGMMV 侵染25 d 后呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，其靶基因Cla013523(TCP)在CGMMV 侵染25 d表現(xiàn)為顯著下調(diào)表達(dá)，另一個(gè)靶基因Cla013668(MYB)在CGMMV 侵染25 d 后表達(dá)量無(wú)差異。

表5 RNA-Seq 分析MIR319 靶基因在CGMMV 不同侵染階段的表達(dá)Table 5 Expression of MIR319 target genes during the process of CGMMV infection by RNA-Seq

此外，利用qRT-PCR 對(duì)MIR319 靶基因在CGMMV 不同侵染階段的表達(dá)進(jìn)行分析，其中Cla013523(TCP)和Cla019567(TCP)在CGMMV 不同侵染階段的表達(dá)模式一致，即與CK 相比，Cla013523(TCP)和Cla019567(TCP)在CGMMV 侵染48 h 和25 d 后呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)表達(dá)；Cla002428(TCP)和Cla023342(TCP)在CGMMV 不同侵染階段的表達(dá)模式一致，即與CK 相比，Cla002428(TCP) 和Cla023342(TCP)CGMMV 侵染48 h 后呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在CGMMV 侵染25 d 后呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；與CK 相比，Cla013668(MYB)在CGMMV 侵染48 h 和25 d 后呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)(圖8)。qRT-PCR 結(jié)果表明，絕大部分靶基因在CGMMV 不同侵染階段的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一致。上述轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及qRT-PCR 結(jié)果均表明，miR319a 對(duì)靶基因Cla013523(TCP)的表達(dá)表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控。

圖6 降解組測(cè)序鑒定MIR319 剪切靶基因的位點(diǎn)Fig.6 Cleavage sites of target gene predicted by degradome sequencing

3 討論

圖7 ScanProsite 預(yù)測(cè)MIR319 靶基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.7 Domain prediction of MIR319 target gene using ScanProsite

圖8 qRT-PCR 分析MiR319 的靶基因在CGMMV 不同侵染階段的表達(dá)Fig.8 Expression analysis of MIR319 target genes during the process of CGMMV infection by qRT-PCR

目前，參與植物對(duì)CGMMV 脅迫應(yīng)答的miRNAs越來(lái)越多地被挖掘出來(lái)。對(duì)接種CGMMV 前后的黃瓜進(jìn)行miRNAs 高通量測(cè)序，獲得多個(gè)參與CGMMV 脅迫應(yīng)答的新的保守的miRNAs 成員[26]。本研究前期通過(guò)對(duì)CGMMV 侵染前后的西瓜葉片進(jìn)行miRNAs 高通量測(cè)序，獲得一些參與CGMMV 脅迫應(yīng)答的miRNAs，如miR164b 及miR319[21]。miR164b 通過(guò)靶向NAC轉(zhuǎn)錄因子參與西瓜對(duì)CGMMV 的脅迫應(yīng)答[27]。研究表明，miR319 在植物對(duì)生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用[17-20]。水稻齒葉矮縮病毒(RRSV)侵染可誘導(dǎo)miR319 的表達(dá)，抑制靶基因TCP21 的表達(dá)，JA 水平降低，表明RRSV 侵染可誘導(dǎo)miR319 介導(dǎo)的防御機(jī)制[19]。因此，進(jìn)一步對(duì)miR319 及靶基因進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)分析可為揭示miR319 對(duì)CGMMV 脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究對(duì)鑒定到的西瓜MIR319 前體基因Pre-MIR319 進(jìn)行序列分析，顯示Pre-MIR319長(zhǎng)度為170 bp，可形成穩(wěn)定的二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。西瓜MIR319 成熟序列在5′端第2 ～第14 位堿基具有較高的保守型，可保證MIR319 對(duì)靶基因的精確切割。對(duì)MIR319 前體序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，顯示Pre-MIR319 進(jìn)化關(guān)系與馬鈴薯miR319a 的前體基因(MI0025952)最近。

研究表明miR319 與其他miRNAs 存在相互作用。植物miR159 主要靶向MYB轉(zhuǎn)錄因子，miR319 主要作用于TCP轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)miR319 家族與miR159 家族關(guān)系密切，它們的靶基因在21 個(gè)核苷酸中有17 個(gè)具有共享序列，miR159 和miR319 的功能特化是通過(guò)表達(dá)差異和序列差異實(shí)現(xiàn)的[28]。本研究中西瓜miR319 的2 個(gè)靶基因Cla013523 和Cla019567，同時(shí)也作為miR159 的靶基因，受到miR159 和miR319的共同調(diào)控。除此之外，miR319 與miR172 也存在相互作用，miR319 前體異常的長(zhǎng)折疊結(jié)構(gòu)與miR172 的加工有關(guān)[29]。

MIR319 和TCP的mRNA 幾乎互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成了基因調(diào)控的分子機(jī)制[30]。MIR319 單核苷酸突變可降低其靶向5 個(gè)TCP基因的能力[13]。本研究中，西瓜MIR319 家族的3 個(gè)成員靶向4 個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子基因，1 個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，剪切位點(diǎn)在MIR319 家族成員成熟序列5′端第10 位堿基。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，僅miR319a 與靶基因Cla013523(TCP)的表達(dá)表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。分析其原因主要是同一個(gè)靶基因受不同miRNAs 的調(diào)控，如Cla019567(TCP)除受miR319和miR319a-3p 的調(diào)控，還受miR159 的調(diào)控，調(diào)控機(jī)制較雜，需進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)miR319 的靶基因TCP調(diào)控JA 的生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。RRSV 侵染一方面誘導(dǎo)miR319 的表達(dá)，抑制TCP21 的表達(dá)，另一方面水稻內(nèi)源JA 水平降低，表明RRSV 可誘導(dǎo)JA 介導(dǎo)的防御機(jī)制，調(diào)控水稻對(duì)RRSV 的抗性[19]。本研究通過(guò)對(duì)Pre-MIR319 啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif 和TGACG-motif，說(shuō)明西瓜MIR319 也可能通過(guò)參與JA介導(dǎo)的防御反應(yīng)調(diào)控西瓜對(duì)CGMMV 的脅迫應(yīng)答。

4 結(jié)論

本研究獲得西瓜MIR319 家族3 個(gè)成員的前體基因序列，系統(tǒng)進(jìn)化分析將多個(gè)物種的miR319 前體基因分為四個(gè)分支。Pre-MIR319 啟動(dòng)子區(qū)含有多個(gè)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答的順式作用元件，降解組測(cè)序獲得MIR319 家族3 個(gè)成員的5 個(gè)靶基因，其中4個(gè)為TCP轉(zhuǎn)錄因子，1 個(gè)為MYB轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及qRT-PCR 對(duì)MIR319 的靶基因在CGMMV 脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析，miR319a 對(duì)靶基因Cla013523(TCP)的表達(dá)表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控。本研究明確了MIR319 家族成員及其靶基因?qū)GMMV 的應(yīng)答模式，為西瓜CGMMV 抗性基因(因子)獲得及分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。