楊延兵 張會笛 陳桂玲 張 晗 王雪梅 王潤豐 秦 嶺 管延安

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/山東省特色作物工程實驗室，山東 濟(jì)南 250100)

谷子[Setaria italica(L.) Beauv.]起源于中國，有上萬年的栽培歷史[1-3]，目前仍是中國北方旱作農(nóng)業(yè)的重要作物。全國谷子播種面積約200 萬hm2，主要集中在河北、山西、內(nèi)蒙、吉林、黑龍江、遼寧、陜西、甘肅、河南和山東等地；谷子主產(chǎn)區(qū)大體可分為華北夏谷區(qū)、東北春谷區(qū)、西北高原早熟春谷區(qū)、西北高原中晚熟春谷區(qū)。1980年以后，我國谷子育種形成了以雜交育種為主、誘變育種等其他育種手段為輔的多途徑育種局面，育種家采用雜交、輻射、細(xì)胞工程等手段育成了大量谷子新品種[4]。其中部分品種在生產(chǎn)上應(yīng)用面積大、時間長，有的品種作為重要親本育成了較多品種，成為骨干性谷子品種。育種實踐表明，農(nóng)作物品種更替與新型骨干親本的挖掘創(chuàng)制和有效利用具有緊密聯(lián)系[5]，因此，對骨干谷子品種具有的特征、形成的遺傳基礎(chǔ)和高效利用等方面進(jìn)行研究，具有重要意義。

上世紀(jì)80年代河南省安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的豫谷1 號，是一個具有里程碑意義的品種。它不僅突破了夏谷畝產(chǎn)超千斤的難關(guān)，豐富了夏谷高產(chǎn)理論；同時打破了谷子品種對光照反應(yīng)敏感、適應(yīng)性窄、地域性強(qiáng)、推廣時限短的傳統(tǒng)觀點[6]。以豫谷1 號為親本育成了豫谷3 號、豫谷4 號、豫谷5 號、豫谷9 號、冀谷11、冀谷12、冀谷13、魯谷10、濟(jì)8062-8、濰坊286、滄615 等一大批谷子品種；近幾年育成的中矮稈優(yōu)質(zhì)谷子品種中谷1 號、豫谷18、中谷2 等[7]也是以豫谷1 號作為親本。2013年美國科學(xué)家對豫谷1 號進(jìn)行了谷子基因組測序[8]。矮88 是以鄭矮2 號為親本，應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)育成的“緊湊型”谷子新品種，以矮88 作為重要矮源育成了如中谷2、冀谷19 等一些代表性品種；而冀谷19 是以矮88 為母本育成的品質(zhì)和產(chǎn)量均優(yōu)的中稈型品種，在2007—2015年期間曾經(jīng)作為華北夏谷區(qū)區(qū)域試驗的對照品種；以冀谷19 作為重要親本也育成如中谷1 號、冀谷31、豫谷19 等品種。晉谷21 由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物所利用輻射技術(shù)于1991年選育成功，以其米質(zhì)優(yōu)而著名，至今仍在生產(chǎn)上大面積種植，是我國春谷區(qū)優(yōu)質(zhì)谷子品種選育的里程碑。西北早熟春谷區(qū)的大同29 是采用不育材料和多親本雜交，混合選擇，采用輪選方法育成的谷子品種，從2007年一直作為西北早熟春谷區(qū)區(qū)域試驗和聯(lián)合鑒定試驗的對照品種。龍谷25 是由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的優(yōu)質(zhì)谷子品種，作為地理標(biāo)識產(chǎn)品“肇東小米”的選用品種。山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的濟(jì)谷12、內(nèi)蒙古赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究院選育的赤谷10 號、河北省滄州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的滄谷4 號、陜西省延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院育成的延谷12 號等都是具有區(qū)域代表性的谷子品種。這些谷子多具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆等優(yōu)異性狀，在生產(chǎn)上應(yīng)用面積較大，利用時間長，為區(qū)域谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。對這些具有代表性的骨干谷子品種進(jìn)行鑒定和遺傳價值利用分析，可為谷子品種選育提供有益參考。

隨著谷子全基因組測序的完成[8-9]，簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)標(biāo)記的開發(fā)[10-12]，利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對谷子進(jìn)行了圖譜構(gòu)建、群體結(jié)構(gòu)、關(guān)聯(lián)分析等方面的研究[13-15]。Wang 等[16]利用77個SSR 標(biāo)記對中國國家基因庫(China National Gene Rank，CNGB)保存的250 個谷子地方品種進(jìn)行了基因型分析，結(jié)果表明各地方品種間的遺傳多樣性較高，平均每個位點有20.9 個等位基因；通過結(jié)構(gòu)、鄰域連接和主成分分析，將這些資源劃分為3 個類群，這些類群與我國生態(tài)地理分布具有良好的一致性。Jia 等[17]用SSR 標(biāo)記對我國近60年來不同地理區(qū)域的優(yōu)良谷子品種進(jìn)行了基因型分型，對我國谷子生產(chǎn)的兩個生態(tài)地理區(qū)域?qū)?yīng)的兩個亞種群進(jìn)行了清晰的分離，其研究結(jié)果表明新育成的優(yōu)良品種中，大量的遺傳資源已經(jīng)從春播轉(zhuǎn)化為夏播生態(tài)型，并推測這種轉(zhuǎn)化可能是由于育種對種植配置的響應(yīng)，強(qiáng)調(diào)了種植結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變和育種偏好對作物品種遺傳進(jìn)化的影響。秦嶺等[18]分析了1980—2015年華北夏谷區(qū)育成的20 個主栽品種的遺傳變異，表明隨著年代遞進(jìn)育成品種的遺傳差異減小，親緣關(guān)系增近。針對不同地區(qū)谷子資源的遺傳多樣性也有較多的研究[19-22]，利用生物信息學(xué)等方法也鑒定了一些與谷子抗性有關(guān)的基因，為谷子的遺傳改良提供了基礎(chǔ)[23-24]。然而，針對不同生態(tài)區(qū)來源的特定骨干谷子品種進(jìn)行鑒定和遺傳價值利用分析的研究較少。本研究對12 個不同生態(tài)區(qū)來源的骨干性谷子品種進(jìn)行表型鑒定，分析這些骨干谷子品種間的遺傳差異及可能的遺傳利用價值，以期為谷子遺傳改良提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

來源于不同生態(tài)區(qū)的12 個骨干谷子品種或親本材料詳見表1。

表1 12 個谷子品種的來源、選育單位和生態(tài)區(qū)Table 1 The sources，breeding institutions and eco-regions of twelve foxtail millet cultivars

1.2 試驗方法

1.2.1 表型鑒定 試驗材料種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所濟(jì)南試驗基地，行長3 m，行距0.5 m，每品種種植4 行，2 次重復(fù)，觀察記載抽穗期、成熟期等物候期。成熟期每小區(qū)取樣10 株，測定谷子株高、穗長、穗粗、穗下節(jié)間長、單穗重、千粒重。碾米觀察米色，并測定小米的黃色素含量，黃色素含量測定參照楊延兵等[25]的方法。

1.2.2 DNA 提取 抽穗期取上部葉片，液氮速凍，用于DNA 提取。谷子基因組DNA 提取采用CTAB法[26]，利用1%的瓊脂糖電泳檢測DNA 的質(zhì)量，DNA樣品在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SSR 引物、PCR 反應(yīng)及凝膠電泳 SSR 引物由張晗等[10]、孫加梅等[19]基于谷子參考基因組開發(fā)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系20 μL:1 μL 模板DNA，正反向引物各1 μL(10 mmol·L-1)，7 μL 雙蒸水，10 μL PCR 擴(kuò)增混合液。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min；94℃變性2 min，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行分離。電泳緩沖液用1×Tris-硼酸(Tris-boric acid，TBE)，上樣量為4 μL，使用DYY-6C 型電泳儀(北京六一儀器廠)電泳，200 V 恒定電壓法電泳1 h。電泳結(jié)束后，將膠板依次在10%無水乙醇、0.5%冰醋酸中浸泡3 min，水洗2 次，再于0.2%硝酸銀中浸泡5 ～7 min，快速用水沖洗后在3%氫氧化鈉中顯影至帶型清晰，然后將膠板取出用水沖洗，晾干拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 根據(jù)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增片段遷移率的不同分別讀取數(shù)據(jù)，對穩(wěn)定擴(kuò)增的多態(tài)性電泳譜帶按有帶記為1，無帶記為0，利用Microsoft Office 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，并依據(jù)分析軟件的要求相應(yīng)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)格式。利用Powermarker 3.25 軟件計算各位點的遺傳多樣性指標(biāo)[27]，包括等位變異數(shù)、多態(tài)性信息含量(polymorphic information content，PIC)等。利用NTSYSpc 2.10 軟件計算位點的遺傳距離(genetic distance，GD)，以非加權(quán)平均數(shù)(unweighted pair-group method with arthmetic mean，UPGMA)進(jìn)行遺傳聚類分析，繪制樹狀圖。利用Structure 2.3.4 軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，StructureHarvester 在線分析確定適宜的K 值[28-29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨干谷子品種的主要農(nóng)藝及米色品質(zhì)性狀鑒定

各谷子品種的主要農(nóng)藝性狀及米色品質(zhì)差異如表2。12 個品種株高均值110.0 cm，變幅69.8 ～135.6 cm；華北夏谷區(qū)矮88 最矮，西北中晚熟春谷區(qū)的延谷12 最高。單穗重均值13.0 g，變幅6.8 ～17.8 g，內(nèi)金香玉單穗重最低，豫谷1 號單穗重最高。穗下節(jié)間長均值29.0 cm，變幅17.4～38.9 cm，矮88 最短，內(nèi)金香玉最長。華北夏谷種植條件下，各生育期平均85.5 d，變幅78～95 d，內(nèi)金香玉最短，延谷12 最長。12 個品種中內(nèi)金香玉為白米品種，大同29 米色淺黃，其他米色黃。黃色素含量測定均值20.5 mg·kg-1，變幅1.8～31.0 mg·kg-1，內(nèi)金香玉最低，晉谷21 最高。各性狀變異系數(shù)黃色素含量最大，單穗重次之。

2.2 谷子品種SSR 標(biāo)記的遺傳多態(tài)性

利用303 對引物對12 個谷子品種進(jìn)行擴(kuò)增，其中98 對引物SSR 標(biāo)記擴(kuò)增出清晰條帶，79 對引物具有多態(tài)性，19 對引物條帶單一，沒有多態(tài)性。利用Powermarker 3.25 計算79 對多態(tài)性引物位點的等位基因數(shù)、PIC 等指標(biāo)(表3)。單個引物檢測到的等位變異數(shù)為2 ～5 個，79 對引物共檢測到258 個等位變異，平均每個位點3.265 8 個，79 個標(biāo)記位點PIC 的變幅為0.141 1 ～0.711 6，平均為0.510 1，最高為S232(0.711 6)，最低為S18(0.141 1)。其中PIC≥0.5 的引物有50 個，占全部多態(tài)性位點的63.3%；0.25＜PIC＜0.5 的引物有26 個，PIC＜0.25 的引物3 個。

2.3 骨干谷子品種間遺傳距離分析

利用NTSYS-pc 2.10 計算各品種的遺傳距離如表4。遺傳距離變幅為0.140 2 ～0.801 1，平均遺傳距離為0.473 7；來自華北夏谷區(qū)滄谷4 號與豫谷1 號的遺傳距離最近為0.140 2，華北夏谷區(qū)育成品種滄谷4 號與西北早熟春谷區(qū)地方品種內(nèi)金香玉的遺傳距離最遠(yuǎn)為0.801 1。品種遺傳距離(GD)根據(jù)大小可分為3類:較小(GD＜0.4)、中等(0.4≤GD≤0.6)、較大(GD＞0.6)。華北夏谷區(qū)濟(jì)谷12、冀谷19、滄谷4、豫谷1這4 個品種遺傳距離都較小，材料之間的遺傳差異小，親緣關(guān)系近；西北中晚熟春谷區(qū)的晉谷21、晉谷30、延谷12 的遺傳距離中等；西北早熟春谷區(qū)的內(nèi)金香玉、赤谷10 之間遺傳距離較小，而大同29 與內(nèi)金香玉、赤谷10 遺傳距離中等。

豫谷1 號與春谷區(qū)品種晉谷21、晉谷30 遺傳距離中等，與其他春谷區(qū)品種遺傳距離較大。矮88 與晉谷21、大同29、內(nèi)金香玉、延谷12、赤谷10 距離較大，與其他品種遺傳距離中等。冀谷19 與大同29、內(nèi)金香玉遺傳距離較大，與其他春谷區(qū)品種遺傳距離中等。晉谷21 除與矮88 距離較大，與其他10 個品種距離中等。大同29 與濟(jì)谷12、滄谷4、豫谷1、晉谷30 遺傳距離較大，與其他品種遺傳距離中等。地方品種內(nèi)金香玉與來自同一生態(tài)區(qū)的育成品種赤谷10 遺傳距離較小，與5 個華北夏谷區(qū)品種、春谷中晚熟品種晉谷30、延谷12 遺傳距離較大。來自東北春谷區(qū)的龍谷25 除與豫谷1 號的遺傳距離較大之外，與其他所有品種遺傳距離中等。

表2 12 個谷子品種的主要農(nóng)藝及米色品質(zhì)性狀Table 2 Main agronomic and quality traits of foxtail millet cultivars

表3 79 對SSR 引物的遺傳多樣性統(tǒng)計Table 3 The genetic diversity of seventy-nine pairs of SSR primers

表3(續(xù))

表3(續(xù))

總體來說華北夏谷區(qū)的5 個品種之間遺傳距離較小，不同生態(tài)區(qū)來源之間的遺傳距離中等或較大，尤其是華北夏谷區(qū)來源骨干谷子品種和西北春播早熟區(qū)的遺傳距離相對較大。

2.4 骨干谷子品種的聚類分析

利用UPGMA 方法對12 個谷子品種進(jìn)行聚類分析(圖1)。在遺傳相似系數(shù)為0.870 時，12 個谷子品種完全分開。在遺傳相似系數(shù)為0.594 處，12 個谷子品種被分為兩大類，來自華北夏谷區(qū)的5 個品種濟(jì)谷12、滄谷4 號、豫谷1 號、冀谷19 號和矮88聚為一類；而所有春谷區(qū)(包括東北、西北早熟、西北中晚熟春谷區(qū))的7 個品種大同29 號、內(nèi)金香玉、赤谷10 號、晉谷30 號、晉谷21、延谷12 號、龍谷25 聚為一類。進(jìn)一步劃分，在遺傳相似系數(shù)為0.626 處，12 個品種被分為4 個亞類，來自華北夏谷區(qū)的濟(jì)谷12、滄谷4 號、豫谷1 號、冀谷19 號和矮88 的5 個品種仍聚為一類；來自中晚熟春谷區(qū)的晉谷21、晉谷30 號和延谷12 號聚為一類，來自西北早熟春谷區(qū)的內(nèi)金香玉、赤谷10 號和東北春谷區(qū)的龍谷25 號聚為一類，大同29 號自成一類，這說明華北夏谷區(qū)品種在遺傳基礎(chǔ)上和春谷區(qū)品種存在較大差異。地理來源相對較近的品種聚在一起，說明聚類分析結(jié)果和品種的生態(tài)類型具有較高的一致性。

表4 12 個谷子品種之間的遺傳距離Table 4 The genetic distance among twelve foxtail millet cultivars

圖1 12 個谷子品種SSR 標(biāo)記的聚類圖Fig.1 Cluster diagram of twelve foxtail millet cultivars based on SSR marker

2.5 谷子品種群體結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件StructureHarvester 確定谷子品種群體適宜的K 值為2。群體結(jié)構(gòu)分析(圖2-A)可以看出來源于華北夏谷區(qū)4 個品種濟(jì)谷12、冀谷19、滄谷4號、豫谷1 號可歸為群1(稱為POP1)；而矮88 和來自春谷區(qū)的7 個品種歸為群2(稱為POP2)；對POP2 進(jìn)行進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(圖2-B)，來自西北中晚熟春谷區(qū)的晉谷21、晉谷30、延谷12 聚為一亞群，命名為POP2-1，來自西北早熟春谷區(qū)的赤谷10、內(nèi)金香玉為一群，命名為POP2-2，而來自東北春谷區(qū)龍谷25、華北夏谷區(qū)的矮88 和西北早熟春谷區(qū)的大同29 聚為一群，命名為POP2-3；來自華北夏谷區(qū)的冀谷19 帶有部分POP2 的血統(tǒng)，晉谷30 和矮88 明顯帶有POP1 的血統(tǒng)，不同生態(tài)區(qū)來源品種之間存在基因交流。

3 討論

3.1 骨干品種表型遺傳多樣性

圖2 12 個谷子品種的群體結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Population structure analysis of twelve foxtail millet cultivars

12 個谷子品種表型性狀存在較大差異，矮88 最矮，生育期短，其作為重要的矮源，含有隱形矮稈基因，可能受多個矮稈基因控制[30]，以其為親本育成品種較多，研究矮88 生育期短、株高較矮的遺傳機(jī)理對于降低谷子株高，增強(qiáng)谷子抗倒性，培育成熟期早的品種具有重要意義。谷子單穗重是非常重要的性狀，豫谷1號單穗重最高，以其為親本育成品種較多，研究利用豫谷1 號的廣適性、高配合力挖掘相關(guān)基因，對于谷子育種具有重要意義。Fang 等[31]利用豫谷1 號和隴谷7號雜交構(gòu)建了1 個高密度連鎖圖譜，共鑒定出29 個與農(nóng)藝性狀有關(guān)的QTL，其中有22 個有利等位基因來自于豫谷1 號，隨著豫谷1 號谷子基因組測序完成，高密度連鎖圖譜構(gòu)建，為挖掘更多的優(yōu)異基因提供了可能。米色尤其是小米的黃色素含量是重要的性狀，對于小米的商品性有重要影響[32]。本研究12 個谷子品種的平均黃色素含量為20.5 mg·kg-1，白米品種內(nèi)金香玉最低，晉谷21 黃色素含量最高；晉谷21 作為優(yōu)質(zhì)品種，在培育較高黃色素含量的品種方面有潛在優(yōu)勢。

3.2 品種的等位變異位點多態(tài)性

79 對SSR 多態(tài)性引物對12 個骨干谷子品種擴(kuò)增，共檢測出258 個等位變異，平均每對引物檢測到3.265 8 個等位變異數(shù)，PIC 值變異范圍0.141 1 ～0.711 6，其中PIC＞0.5 位點有50 個。品種間SSR 基因座變異數(shù)相對較少[16-17，33]，可能與本研究骨干品種數(shù)量相對較少有關(guān)。但是79 個SSR 多態(tài)性位點中PIC＞0.5 位點有50 個，說明這些不同生態(tài)區(qū)來源骨干品種在這些位點上存在較豐富的變異，這些位點可用于品種的真實性鑒定。另外利用谷子的多態(tài)性位點挖掘更多的優(yōu)異基因位點或區(qū)段，解析其遺傳基礎(chǔ)，并鑒定與產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病、株型等重要性狀關(guān)聯(lián)基因位點等工作，尚需進(jìn)一步研究。

3.3 品種的遺傳距離、聚類分析和遺傳結(jié)構(gòu)

華北夏谷區(qū)來源骨干品種間遺傳距離和其他生態(tài)區(qū)來源品種相比相對較小，其遺傳基礎(chǔ)較其他生態(tài)區(qū)品種窄，可能與同一生態(tài)區(qū)內(nèi)少數(shù)骨干親本的重復(fù)利用有關(guān)[18]。華北夏谷區(qū)品種和其他春谷區(qū)品種，尤其西北早熟春谷區(qū)品種遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此要擴(kuò)大華北夏谷區(qū)品種的變異，豐富其變異類型，應(yīng)加強(qiáng)華北夏谷區(qū)品種與西北早熟春谷區(qū)品種之間的基因交流，為優(yōu)質(zhì)、早熟谷子品種選育提供基礎(chǔ)。

聚類分析表明遺傳相似系數(shù)為0.594 時，12 個谷子品種被分為兩大類。華北夏谷區(qū)來源的5 個品種聚為一類；其他所有春谷區(qū)類型聚為一類，夏谷品種和春谷品種存在較大的差異。這與Jia 等[17]認(rèn)為我國谷子品種大體可分為春播和夏播兩種類型的結(jié)論類似，但具體的生態(tài)區(qū)劃分有一定差異。本研究聚類結(jié)果和品種的生態(tài)類型基本一致，同一生態(tài)區(qū)類型的品種大體可以聚為一類。這與Wang 等[16]對中國谷子地方品種的研究結(jié)果基本一致；而Liu 等[33]研究認(rèn)為，品種聚類主要與系譜來源有關(guān)，而與地理來源沒有必然關(guān)系，結(jié)果的差異與選擇的材料有關(guān)。綜上，谷子遺傳多樣性聚類與品種系譜以及地域來源有一定的相關(guān)性。

運(yùn)用Structure 軟件分析谷子品種的遺傳結(jié)構(gòu)，考察品種間基因的交流，12 個品種可分為2 個群。分群的結(jié)果與NTSYS-pc 的聚類分析略有差異，可能與不同軟件間算法存在差異有關(guān)。矮88 和其他7 個春谷區(qū)品種具有相似的遺傳結(jié)構(gòu)，與來自西北早熟區(qū)的品種大同29 和來自東北區(qū)的品種龍谷25 歸為一亞群，說明矮88 在遺傳結(jié)構(gòu)上可能與春谷區(qū)的品種相似性較大，其遺傳基礎(chǔ)和其他夏谷區(qū)差異較大。

4 結(jié)論

不同生態(tài)區(qū)骨干谷子品種間在表型性狀及遺傳基礎(chǔ)上具有較大的差異，不同生態(tài)區(qū)來源品種之間遺傳差異較大，同一生態(tài)區(qū)來源品種之間差異較??；華北夏谷區(qū)品種遺傳差異較其他生態(tài)區(qū)品種遺傳差異相對較小，華北夏谷區(qū)品種和西北早熟春谷區(qū)品種間遺傳差異較大，華北夏谷區(qū)品種要實現(xiàn)品質(zhì)、產(chǎn)量和抗性的突破，豐富本生態(tài)區(qū)品種的遺傳變異，應(yīng)加強(qiáng)與西北早熟區(qū)品種間的遺傳交流。