張瑞芳 張合紅 魏中艷 陳劍平 孫宗濤

(1 福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002； 2寧波大學植物病毒學研究所，浙江 寧波 315211)

水稻(Oryza sativaL.)在我國具有悠久的種植歷史，是重要的糧食作物之一。近年來由于環(huán)境及氣候的變化，水稻病毒病大面積爆發(fā)，嚴重威脅水稻產(chǎn)量[1]。南方水稻黑條矮縮病毒(southern rice black streak dwarf virus，SRBSDV) 是由介體白背飛虱(Sogatella furcifera，WBPH)進行傳播的雙鏈RNA 病毒[2-3]，于2001年在廣東省首次發(fā)現(xiàn)。水稻各個發(fā)育時期均可被該病毒侵染，發(fā)病癥狀為植株矮化、葉片顏色深綠、節(jié)部有氣生須根及高節(jié)位分枝、莖稈表面有乳白色瘤狀突起、根系不發(fā)達且須根少而短、一般不抽穗或抽包頸穗、結(jié)實率低[4-5]。

根據(jù)SRBSDV 基因組序列特性，將其歸為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)第二小組。其病毒粒子呈正二十面體球狀對稱結(jié)構(gòu)，直徑約75 ～80 nm，具有多層結(jié)構(gòu)，病毒核心粒子(直徑50 ～55 nm)光滑無刺突，病毒粒子的內(nèi)衣殼有塔狀B-刺突，外衣殼具有B-刺突和A-刺突。SRBSDV 病毒粒子對有機溶劑非常敏感，因此實驗室使用氯仿處理純化后可得到表面光滑的病毒粒子[6-7]。SRBSDV 在基因組序列水平上與水稻黑條矮縮病毒(rice black-streakeddwarf virus，RBSDV)最為相似，均由十條雙鏈RNA 組成，根據(jù)它們在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率，由慢到快，依次命名為S1 ～S10；該病毒的全基因組由29 106～29 115 bp 個核苷酸組成，其中S5、S7 和S9 均有2 個開放閱讀框，共編碼13 個蛋白，S10 大小為1 797 bp，編碼P10 蛋白，大小為65.9 kDa，是病毒粒子的外殼蛋白[8]。在植物病毒中外殼蛋白是研究最早、最廣泛的病毒蛋白之一[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，RBSDV P10 具有自互作[10-11]，通過免疫熒光蛋白技術(shù)觀察到RBSDV P10 定位在細胞核及質(zhì)膜上[12]。在水稻中表達RBSDV P10 可介導(dǎo)植物的抗病毒能力[13]，但關(guān)于P10 在SRBSDV 侵染過程的作用機制，以及對寄主因子的選擇，國內(nèi)外鮮見相關(guān)研究報道?；诖?，本研究對SRBSDV P10 蛋白功能展開研究，通過對寄主因子功能的研究揭示P10 蛋白及其互作寄主因子在病毒侵染循環(huán)中的作用。酵母雙雜交是一種用來篩選蛋白互作因子的常見技術(shù)手段，在分子生物學研究領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。該技術(shù)不僅可以檢測已知功能蛋白間的互作，還可以設(shè)計已知功能的蛋白質(zhì)作為誘餌蛋白，從酵母文庫中釣取與其互作的未知蛋白[14]，或者用未知功能的蛋白質(zhì)作為誘餌蛋白進行酵母文庫篩選，通過研究已知功能的獵物蛋白推測誘餌蛋白的功能[15]。因此本研究通過DUAL膜系統(tǒng)(DUAL membrane system) 酵母雙雜系統(tǒng)來篩選水稻中與SRBSDV P10 互作的寄生蛋白。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻品種為日本晴，種植于山東省農(nóng)業(yè)科學院實驗田中，水稻幼苗自然感病SRBSDV 后，取樣送上海歐易生物技術(shù)公司提取RNA，并構(gòu)建酵母雙雜交膜體系cDNA 文庫；文庫與酵母表達載體pBT3-SUC、pBT3-STE 以及pBT3-N 均來自上海海科生物科技有限公司；大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)購自杭州雅邦生物科技有限公司；酵母感受態(tài)(NMY51)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。Trizol 購自生工生物工程(上海)股份有限公司；cDNA 合成試劑盒購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；KOD FX 高保真擴增酶購自日本TOYOBO公司；Thermo Scientific FastDigest Sfi1 購自加拿大Fermentas 公司；PEG-LiAc 購自南京百思禾生物科技有限公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Promega 公司。

1.2 誘餌表達載體的構(gòu)建

根據(jù)SRBSDV P10 的編碼序列(coding sequence，CDS)設(shè)計引物進行PCR 擴增，表1 為RT-PCR 基因擴增特異性序列。PCR 體系為50 μL:25 μL 2×PCR Buffer、5 μL 2 mmol·L-1dNTPs、引物-F 和引物-R 各1.5 μL、cDNA 模板和KOD FX 高保真擴增酶各1 μL、15 μL 無菌水補全體積。將上述試劑混勻后按以下程序進行PCR 擴增:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min，然后進行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。

表1 RT-PCR 基因擴增特異性序列Table 1 RT-PCR gene amplification specific sequences

誘餌載體酶切位點為Sfi1，單酶切體系為50 μL:pBT3-SUC、pBT3-STE 或pBT3-N 質(zhì)粒40 μL；10×Fast Green Buffer 5 μL；Sfi1 內(nèi)切酶5 μL?；旌暇鶆蚝笥?7℃水浴鍋放置30 min 后進行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，回收產(chǎn)物即為pBT3-SUC、pBT3-STE 與pBT3-N 載體。將回收的PCR 產(chǎn)物與載體按10 μL 體系連接。于0.2 mL PCR 管中依次加入4.5 μL PCR 產(chǎn)物、2.5 μL 載體片段、2 μL 5×CEⅡBuffer、1 μL 重組酶，混合均勻后放入PCR 儀(德國Eppendof 公司)，連接程序為37℃，30 min。將連接產(chǎn)物加到50 μL DH5α 感受態(tài)中，冰上放置30 min 后放入42℃水浴鍋中熱激90 s，加入無抗LB 液體培養(yǎng)基于37℃搖床培養(yǎng)1 h，5 000 r·min-1離心收菌涂布于LB(luria-bertani)固體培養(yǎng)基(加入Kan 抗生素)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后挑取單克隆進行測序，由杭州擎科梓熙生物有限公司完成。將測序結(jié)果正確的菌落進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用于后續(xù)文庫篩選。

1.3 酵母自激活檢測和功能檢測

取實驗室已購酵母NMY51 菌株，劃線于YPDA(yeast extract peptone dextrose adenine medium)固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3 d，挑取生長旺盛的白色單克隆于4 mL 液體培養(yǎng)基，30℃、225 r·min-1振蕩培養(yǎng)18～20 h(過夜)，至OD600＝4。轉(zhuǎn)接YPDA 液體培養(yǎng)基，體積為50 mL，使初始OD600＝0.2，30℃、225 r·min-1振蕩培養(yǎng)4～5 h，至OD600＝0.6，室溫下4 000 r·min-1離心5 min收菌，棄上清。用20 mL 無菌水重懸菌體后混勻，室溫下4 000 r·min-1離心5 min 收菌，棄上清。用5 mL 0.1 mol·L-1LiAc 重懸菌體混勻，室溫下4 000 r·min-1離心5 min 收菌，棄上清。用500 μL 0.1 mol·L-1LiAc 重懸菌體后混勻，分裝至1.5 mL 離心管，每個50 μL，依次加入400 μL PEG-LiAc、10 μL 鮭魚精DNA、以下質(zhì)粒各5 μL，共10 μL 組合:pNubG-Fe65 ＋PTSU2-APP(陽性對照)、pPR3N ＋PTSU2-APP(陰性對照)、PR3N ＋pBT3-STE-P10(自激活檢測1)、pPR3N ＋pBT3-SUCP10(自激活檢測2)、pPR3N＋pBT3-N-P10(自激活檢測3)、pOST1-Nub1 ＋pBT3-STE-P10(功能檢測1)、pOST1-Nub1 ＋pBT3-SUC-P10(功能檢測2)、pOST1-Nub1＋pBT3-N-P10(功能檢測3)用槍頭吹打混勻。將混合液于30℃水浴孵育30 min，之后42℃水浴熱激25 min，再30℃水浴復(fù)蘇30 min。室溫下4 000 r·min-1離心5 min 收菌，棄上清。每個轉(zhuǎn)化用100 μL 無菌水重懸菌體，分別涂布SD-Trp/Leu、SD-Trp/Leu/His、SDAde/His/Leu/Trp 以及SD-Leu 缺陷型篩選平板。30℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，記錄每塊平板上的克隆數(shù)，并計算每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)在缺陷平板上的轉(zhuǎn)化子數(shù)量和生長率。

1.4 文庫篩選

選擇pBT3-SUC-P10 作為篩庫誘餌質(zhì)粒，從轉(zhuǎn)化的SD-Leu 平板上挑取單克隆菌落接種于5 mL SD-Leu液體培養(yǎng)基中，30℃、225 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h 后轉(zhuǎn)接于200 mL YPDA 液體培養(yǎng)基中，30℃、225 r·min-1振蕩培養(yǎng)4～5 h，至OD600＝0.6。室溫下4 000 r·min-1離心5 min 收菌，棄上清。用30 mL 無菌水重懸菌體，混勻后室溫下4 000 r·min-1離心5 min 收菌，棄上清。用20 mL 0.1 mol·L-1LiAc 重懸菌體，混勻后室溫4 000 r·min-1離心5 min 收菌，棄上清。用10 mL 0.1 mol·L-1LiAc 重懸菌體，混勻后室溫4 000 r·min-1離心5 min 收菌，棄上清。向離心管中依次加入以下試劑:200 μL 鮭魚精DNA、5 mL PEG-LiAc、25 μL cDNA 文庫質(zhì)粒，吹打混勻。30℃水浴孵育30 min，42℃水浴熱激25 min，30℃水浴復(fù)蘇1 h。室溫下4 000 r·min-1離心5 min 收菌，棄上清，用4 mL 無菌水重懸菌體，溫和混勻后涂SD-Trp/Leu/His ＋20 mmol·L-13-氨基-1，2，4 -三唑(3，amino-1，2，4-triazde，3AT)，抑制酵母自激活)平板，每100 μL，共40 塊。置于30℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，挑取酵母單克隆轉(zhuǎn)至SD-Ade/His/Leu/Trp 平板，30℃培養(yǎng)2 ～3 d。將SD-Ade/His/Leu/Trp 平板上生長旺盛的酵母菌落轉(zhuǎn)接至SD-Ade/His/Leu/Trp 液體培養(yǎng)基，30℃、225 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h，準備提取酵母質(zhì)粒。

1.5 酵母質(zhì)粒的提取及回轉(zhuǎn)驗證

培養(yǎng)的酵母菌液于12 000 r·min-1離心1 min 后收菌并加入300 μL 的山梨醇緩沖液和50 U 的Lyticase溶壁酶，30℃振蕩培養(yǎng)1 h；室溫條件下12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，加入250 μL 的YP1 溶液(加入RNaseA)，旋渦振蕩15 s 后轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中；向管中加入250 μL 的YP2 溶液，溫和的上下翻轉(zhuǎn)3～5 次，室溫放置6 min，以便充分裂解，此時溶液變得澄清透明，開蓋會有拉絲現(xiàn)象；加入350 μL 的YP3 溶液，立刻溫和的上下翻轉(zhuǎn)6 ～8 次，管內(nèi)產(chǎn)生白色絮狀沉淀；12 000 r·min-1離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12 000 r·min-1離心1 min，重復(fù)過柱可提高吸附效率；加入500 μL 的去蛋白PD 溶液洗去多余的蛋白質(zhì)，12 000 r·min-1離心1 min；加入650 μL 的PW 漂洗液，12 000 r·min-1離心1 min，重復(fù)1 次；將吸附柱空離心2 min 后開蓋2 min，以便充分揮發(fā)殘余的酒精；向吸附柱內(nèi)加入適量的滅菌水，室溫放置5 min 后12 000 r·min-1離心2 min，將酵母質(zhì)粒充分洗脫在新的1.5 mL 離心管中。將提取的酵母質(zhì)粒送杭州擎科梓熙生物有限公司測序，測序成功的質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒pBT3-SUC-P10 分別進行回轉(zhuǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體構(gòu)建

本研究以南方黑條矮縮病毒侵染后的水稻為材料，提取總RNA 后反轉(zhuǎn)為cDNA 作為模板，根據(jù)SRBSDV P10 序列設(shè)計上下游引物進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果與預(yù)期一致，約在1 700 bp 處出現(xiàn)特異性條帶，電泳結(jié)果如圖1 所示。將克隆得到的SRBSDV P10 cDNA 片段連接到pBT3-SUC、pBT3-STE以及pBT3-N 載體中，構(gòu)建pBT3-SUC-P10、pBT3-STEP10 以及pBT3-N-P10。測序結(jié)果表明，以上3 個載體的目的序列正確，成功獲得了誘餌表達載體。

圖1 RT-PCR 克隆P10 全長Fig.1 RT-PCR clone P10 full length

2.2 功能驗證

在檢測膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)的功能時，如果誘餌蛋白在酵母細胞內(nèi)具有表達功能，便會依據(jù)誘餌蛋白在缺少3 種氨基酸的SD-Trp/Leu/His 和缺少4 種氨基酸的SD-Ade/His/Leu/Trp 篩選平板上有10%～100%的生長率，而自激活檢測的SD-Trp/Leu/His 和SD-Ade/His/Leu/Trp 篩選平板上，應(yīng)觀察不到顯著的生長。在表2 陽性對照反應(yīng)中，pTSU2-APP 與pNubGFe65 具有較強的相互作用，而作為陰性對照的pTSU2-APP 與pPR3N 在SD-Trp/Leu/His 和SD-Ade/His/Leu/Trp 篩選平板上的生長明顯少于陽性對照。檢測誘餌基因功能時發(fā)現(xiàn)載體pBT3-N-P10 在SD-THL 篩選平板上生長較好，但在SD-Ade/His/Leu/Trp 篩選平板上生長較少；而pBT3-SUC-P10、pBT3-STE-P10 在SD-Ade/His/Leu/Trp 篩選平板上生長均較好，但在自激活檢測時發(fā)現(xiàn)pBT3-STE-P10 存在自激活，不適合用于篩庫。pBT3-SUC-P10 有功能，雖然存在輕微的自激活，但能被5 mmol·L-1的3AT 所抑制，因此選擇其作為后續(xù)雙雜交篩選試驗的誘餌克隆。

表2 各組酵母在不同培養(yǎng)基上生長克隆數(shù)統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of the number of colonies grown by different groups of yeast on different media

2.3 篩庫結(jié)果

酵母雙雜交膜體系是由酶切連接的方法實現(xiàn)建庫，主要是基于分離的泛素介導(dǎo)膜蛋白互作信號的識別。將含有pBT3-SUC-P10 誘餌質(zhì)粒的NMY51 酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將水稻文庫質(zhì)粒pPR3N-WYQ-Mus-LIV 轉(zhuǎn)入其中，涂SD-Trp/Leu ＋5 mmol·L-13AT 缺陷平板上，培養(yǎng)到第3 天時，挑取生長正常的單克隆劃線于SD-Ade/His/Leu/Trp 缺陷平板上(圖2)，培養(yǎng)3 d 后將陽性克隆酵母菌株分別提取質(zhì)粒測序。

圖2 誘餌質(zhì)粒在不同培養(yǎng)基中的生長情況Fig.2 Growth of bait plasmids in different media

測序結(jié)果在 NCBI ( National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站上進行BLAST 比對。將目的基因序列進行比對分析后，挑選10 個具有全長基因序列的克隆進行統(tǒng)計，結(jié)果如表3 所示，得到基因與已有報道比對分析，包括硫氧還蛋白H1、胚胎晚期富含Lea14-A 蛋白、G 蛋白偶聯(lián)受體107 以及之前有報道的真核翻譯起始因子5A 等與生長發(fā)育及植物抗逆相關(guān)的蛋白。

2.4 回轉(zhuǎn)驗證

根據(jù)上述整理的篩庫結(jié)果，選出感興趣的候選因子，將這些基因進行酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗證。首先將篩選出的含有這些基因片段的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α 大腸桿菌感受態(tài)中，涂氨芐(ampicillin)抗性的LB 平板，分離出獵物蛋白后與 pBT3-SUC-P10 共同回轉(zhuǎn)NMY51，試驗設(shè)置pBT3-SUC-P10 和pPR3N 為陰性對照，共轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂布于SD-Trp/Leu 缺陷平板上，30℃培養(yǎng)箱生長3 d 后將酵母菌落轉(zhuǎn)接至SD-Ade/His/Leu/Trp 缺陷平板上，酵母雙雜交結(jié)果如圖3 所示。P10 蛋白與目的基因片段共轉(zhuǎn)后的產(chǎn)物均能在缺陷培養(yǎng)基上正常生長，陰性對照沒有生長，說明P10 與分離出的獵物蛋白經(jīng)回轉(zhuǎn)驗證后能夠在酵母細胞中發(fā)生互作。

3 討論

圖3 酵母回轉(zhuǎn)驗證P10 與酵母分離獵物蛋白的互作Fig.3 Yeast rotation verification of the interaction between P10 and yeast isolated prey protein

表3 酵母雙雜交篩選陽性克隆的生物學信息統(tǒng)計表Table 3 Biological information statistics of yeast two-hybrid screening of positive clones

本研究前期發(fā)現(xiàn)RBSDV P10 轉(zhuǎn)基因水稻可以增強對RBSDV 及同屬SRBSDV 的抗性，但是在其他病毒如纖細病毒屬的水稻條紋病毒(rice stripe virus，RSV)侵染水稻時會抑制植物防御反應(yīng)[13]，而SRBSDV P10 作為外殼蛋白在病毒侵染寄主植物時的發(fā)揮作用機制尚不明確。已有研究發(fā)現(xiàn)RBSDV P10 定位在細胞質(zhì)膜與細胞核上[12]，而SRBSDV 在功能與結(jié)構(gòu)上與其具有高度同源性，因此本研究選擇DUAL 膜系統(tǒng)酵母雙雜系統(tǒng)篩選與P10 互作的蛋白。DUAL 膜系統(tǒng)酵母體系是一種基于酵母的篩選測定方法，用于鑒定和表征天然狀態(tài)下完整膜蛋白、膜相關(guān)蛋白和可溶性蛋白之間的相互作用，以及在細胞膜上原位檢測全長整合膜蛋白之間的相互作用[16]。

DUAL 膜系統(tǒng)篩庫載體pBT3-SUC、pBT3-STE 以及pBT3-N 具有不同的作用結(jié)構(gòu)域，因此先進行功能驗證以確定篩庫誘餌載體。分別構(gòu)建pBT3-SUC-P10、pBT3-STE-P10 以及pBT3-N-P10 載體，為了驗證篩庫誘餌的自激活與功能檢測，將構(gòu)建好的3 個誘餌質(zhì)粒分別與pPR3N 及pOST1-Nub1 進行一對一酵母雙雜試驗。結(jié)果表明，pBT3-STE-P10 存在自激活，相較于pBT3-N-P10，pBT3-SUC-P10 更具有活性，是最適合進行篩庫的誘餌質(zhì)粒。

利用pBT3-SUC-P10 質(zhì)粒與水稻cDNA 文庫質(zhì)粒進行篩庫，將其轉(zhuǎn)入NMY21 菌株后涂板，在SD-AHLT上生長出來的陽性克隆提取質(zhì)粒測序，篩選到10 個不同的獵物蛋白，將這些蛋白與pBT3-SUC-P10 進行一對一酵母雙雜回轉(zhuǎn)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均具有互作作用。這些蛋白包括與植物早期發(fā)育相關(guān)的胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白Lea14-A、硫氧還原蛋白TRX-H1、鐵硫結(jié)合蛋白IscA 以及真核生物起始翻譯因子eIF-5A 等。胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA 蛋白)主要在植物種子發(fā)育晚期大量積累，且在植物處于逆境時被誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種應(yīng)激蛋白，與抗多種脅迫相關(guān)[17]。水稻中過表達OsLea14-A可以提高對脫水、高鹽及重金屬的耐受性[18]。鐵硫簇是生物學中最常見的氧化還原中心類型之一。已有研究報道，IscA 能夠募集細胞內(nèi)鐵并為蛋白質(zhì)中的鐵硫簇輸送鐵[19]。硫氧還原蛋白(thioredoxin H1-like，Trxs)是植物中蛋白質(zhì)的多基因家族，通過硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)在氧化還原平衡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[20]。水稻中OsTRXh1 調(diào)節(jié)質(zhì)外體的氧化還原狀態(tài)，并影響植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，eIF-5A 并非傳統(tǒng)意義上的真核翻譯起始因子，可能只在某些特殊代謝途徑中合成蛋白時所需[22]。有研究表明在水稻中，OseIF5A與RBSDV P10 發(fā)生互作，并且可能受植物發(fā)育和環(huán)境脅迫的調(diào)節(jié)[23-24]。早期的光誘導(dǎo)蛋白(early light-induced protein，ELIP)屬于光捕獲復(fù)合物的多基因家族，它們結(jié)合葉綠素并吸收綠色植物中的太陽能[25-26]。在茶樹[Camellia sinensis(L) O. Ktze.]中，CsELIP基因在茶葉中發(fā)生光抑制時顯著上調(diào)，表明它們可能參與光保護作用[27]，以及在棉花中(Gossypiumspp)發(fā)現(xiàn)GhELIP1 基因在衰老葉片中的表達量最高，表明GhELIP1 基因參與棉花葉片的衰老調(diào)控[28]。這些基因的發(fā)現(xiàn)說明水稻受到病毒侵染時，生長發(fā)育與營養(yǎng)物質(zhì)的合成均受到影響，可為進一步研究SRBSDV 致病機理提供參考。

4 結(jié)論

本研究以南方水稻黑條矮縮病毒外殼蛋白P10作為誘餌載體，通過篩選水稻膜系統(tǒng)酵母雙雜cDNA文庫，找到水稻中與P10 互作的蛋白，結(jié)合生物信息學技術(shù)進行分析，回轉(zhuǎn)驗證，篩選到10 個可能與P10互作的水稻寄主蛋白，為后續(xù)進一步研究P10 蛋白的功能提供了理論依據(jù)。