毛鵬，王麗鴛，白培賢，韋康，阮麗，張亞真，成浩

類茶氨酸合成酶基因家族在番茄中的鑒定及表達(dá)研究

毛鵬1,2，王麗鴛1*，白培賢1，韋康1，阮麗1，張亞真1，成浩1*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

茶樹體內(nèi)的茶氨酸合成酶（Theanine synthetase synthetase，TS）和部分谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）家族成員都具有催化乙胺和谷氨酸合成茶氨酸的活性。我們將植物中這類與茶樹TS序列高度相似，且具有茶氨酸合成活性的酶，統(tǒng)稱為類茶氨酸合成酶（Analogue theanine synthase，ATS）。為了探究ATS在非茶植物中的分布，以及乙胺在茶氨酸合成中的作用，本研究以Mico-Tom番茄為試驗(yàn)材料，對(duì)水培番茄幼苗進(jìn)行了外源添加乙胺處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅在處理組葉片中檢測(cè)到茶氨酸，并且處理組葉片中的谷氨酰胺（Glutamine，Gln）含量也極顯著增加，而丙氨酸含量與對(duì)照相比無顯著變化。利用生物信息學(xué)方法分別從茶樹和番茄基因組中鑒定出12個(gè)和5個(gè)家族成員，它們均含有谷氨酰胺合成酶催化功能的結(jié)構(gòu)域Gln-synt_C；qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，處理組葉片中有2個(gè)（和）表達(dá)量極顯著提高。上述結(jié)果表明，ATS廣泛存在于植物中，而乙胺是合成茶氨酸的關(guān)鍵限制因子，能夠提高基因的表達(dá)，觸發(fā)茶氨酸的合成。

番茄；茶氨酸；乙胺；類茶氨酸合成酶；基因家族

茶樹（）起源于中國(guó)西南地區(qū)，在全球60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有著高達(dá)700萬公頃的種植面積，并與咖啡樹、可可樹一起列為世界三大非酒精飲料經(jīng)濟(jì)植物[1-2]。茶氨酸是茶樹特征性非蛋白質(zhì)游離氨基酸，在提升茶葉品質(zhì)，增強(qiáng)茶湯鮮爽味，以及改善人體健康等方面發(fā)揮了重要作用[3-6]。在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，含有茶氨酸的植物主要是茶樹，其嫩芽和葉片中茶氨酸的含量達(dá)到干重的1%~4%，約占游離氨基酸總量的60%~70%[2]。此外，在山茶屬的個(gè)別成員，以及茶梅、玉米和一些細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)有少量的茶氨酸[7-9]。

茶氨酸主要是在茶樹根部由谷氨酸和乙胺在茶氨酸合成酶（Theanine synthetase，TS）的催化作用下合成[10]。TS在茶苗勻漿中被首次發(fā)現(xiàn)[11]，但以往的研究未能對(duì)其進(jìn)行有效的分離和純化。目前已從茶樹cDNA文庫(kù)中克隆得到TS候選基因（DD410896）、（DD410895）和（TEA015198.1）等；其中，主要在根、芽和葉中表達(dá)，主要在芽中表達(dá)，而（TEA015198.1）則是在根部特異性表達(dá)[9,12-13]。屬于Type Ⅰ GS，并與腐臭假單胞菌中的（BAE44186）基因同源，編碼的FluG蛋白和都被證實(shí)具有合成茶氨酸的能力[9,14]。Deng等[13]對(duì)TS與谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）進(jìn)行核酸序列分析，發(fā)現(xiàn)與（AB117934）相似性達(dá)99%，與（AB115183）相似性達(dá)97%。茶氨酸的生物合成方式與谷氨酰胺合成的酶促反應(yīng)類似[15]，且上述反應(yīng)的產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上也很相似，都屬于酰胺類似物（圖1）。目前通過試驗(yàn)已證實(shí)茶樹谷氨酰胺合成酶基因（MG778703）、（MG778704）、（MG778705）（MG778706）以及擬南芥谷氨酰胺合成酶基因均具有合成茶氨酸的功能[8,16]。此外，利用工程菌的方法也證實(shí)了微生物中的GS[17]、-谷氨酰甲胺合成酶（-glutamylmethylamide synthetase，GMAS）[18]、-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶（-glutamyltrans-peptidase，GGT）[19-20]和-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-glutamylcsteine synthetase，-GCS）[21]均具有合成茶氨酸的能力。

圖1 茶氨酸與谷氨酰胺的生物合成途徑

基于上述研究背景，我們推測(cè)能夠催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的酶是一類同工酶。因此將這類與茶樹TS基因序列高度相似，且具有茶氨酸合成能力的基因，統(tǒng)稱為類茶氨酸合成酶（Analogue theanine synthase，ATS）基因。本研究選取了生長(zhǎng)周期短、植株矮小、自身不含有乙胺和茶氨酸的Mico-Tom番茄作為試驗(yàn)材料[8,22]，對(duì)水培番茄幼苗進(jìn)行了外源添加乙胺的試驗(yàn)處理，以檢測(cè)幼苗葉中是否存在ATS；隨后，利用生物信息學(xué)方法，在茶樹和番茄基因組中進(jìn)行家族成員的鑒定，并對(duì)番茄中的幾個(gè)潛在的關(guān)鍵進(jìn)行表達(dá)分析，以此探究ATS在非茶植物中的存在情況，以及乙胺在茶氨酸合成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所嵊州基地選取一年生龍井43扦插苗，清水沖洗干凈，取根和葉放入冷凍干燥機(jī)（TF-FD-1，上海田楓實(shí)業(yè)有限公司）進(jìn)行冷凍干燥。

將野生型Micro-Tom番茄種子（購(gòu)自武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司）播種在濕潤(rùn)的海綿上，2周后將萌發(fā)的幼苗移入裝有1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的45?cm×30?cm×15?cm水槽，光照培養(yǎng)（白天25℃，夜晚18℃）。一周后選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄幼苗，將其隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組。對(duì)照組和處理組均用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，其中處理組中添加10?mmol·L-1鹽酸乙胺。每5?d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，并且每天用增氧氣泵（ACO-005，森森集團(tuán)股份有限公司）向營(yíng)養(yǎng)液中注入空氣10?h。水培25?d后，分別采摘處理組和對(duì)照組中番茄成熟葉放入液氮中速凍，取一部分葉片放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥備用，另一部分置于–80℃冰箱保存。

1.2 氨基酸和乙胺的提取及測(cè)定

用0.1?mol·L-1鹽酸分別溶解茶氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和乙胺標(biāo)準(zhǔn)品，配制成2.5?μmol·L-1的溶液。取茶氨酸溶液400?μL、谷氨酸溶液100?μL、丙氨酸溶液100?μL、谷氨酰胺溶液100?μL、乙胺溶液100?μL、超純水200?μL于1.5?mL離心管中制成一個(gè)1?mL的混合標(biāo)樣。用分析天平稱取經(jīng)冷凍干燥后的茶樹和番茄樣品并研磨成粉末，其中茶樹組織加入5?mL沸水，番茄組織加入3?mL沸水，在100℃的水浴中浸提30?min，期間晃動(dòng)2~3次，4?000?r·min-1離心10?min后，上清液經(jīng)0.22?μm過濾器過濾待用。

使用AccQ·Tag Ultra衍生試劑盒（Waters，MA，USA）進(jìn)行氨基酸及乙胺的柱前衍生反應(yīng)。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液（混標(biāo)溶液和茶樹提取液為10?μL，番茄提取液為20?μL）與70?μL AccQ·Tag Ultra硼酸鹽緩沖液混勻，再加入20?μL AccQ·Tag試劑并充分混勻，混合液轉(zhuǎn)移至微量進(jìn)樣瓶中，置于55℃下反應(yīng)10?min后，用于超高效液相色譜儀UPLC（Agilent，California，USA）檢測(cè)。流動(dòng)相組成：100% AccQ·Tag Ultra洗脫液A作為溶劑A，10% AccQ·Tag Ultra洗脫液B作為溶劑B，超純水作為溶劑C，100% AccQ·Tag Ultra洗脫液B作為溶劑D。洗脫梯度為：0~0.29?min（10% A，90% C），0.29~5.49?min（9.9% A，90.1% C），5.49~7.10?min（9.0% A，80% B，11% C），7.10~7.69?min（8.0% A，15.6% B，57.9% C，18.5% D），7.69~7.99?min（7.8% A，70.9% C，21.3% D），7.99~8.68?min（4% A，36.3% C，59.7% D），8.68~10.20?min（10% A，90% C）；設(shè)置二極管陣列檢測(cè)器（Photo-diode array，PDA）的波長(zhǎng)為260?nm[23]。

1.3 ATS家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

從Tea Plant Information Archive（TPIA）（http://tpia.teaplant.org）[24]和Phytozome12（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中分別下載茶樹及番茄的基因組、CDS序列和蛋白質(zhì)序列文件。從NCBI中下載（DD410896）、（DD410895）、（MG778703.1）、（MG778704.1）、（MG778705.1）（MG778706）和（TEA015198.1）核酸序列并作為篩選茶樹家族成員的標(biāo)準(zhǔn)基因，利用TBtool[25]中的BLASTP工具與NCBI中的UniProtKB/Swiss-Prot（swissprot）數(shù)據(jù)庫(kù)，基于E值＜10-5及注釋信息去除中的冗余部分。隨后將從茶樹基因組中確定的家族成員作為篩選番茄家族成員的標(biāo)準(zhǔn)基因，按照相同方法在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩選鑒定。最后利用ExPASy（http://web. expasy. org/protparam）分析上述家族成員的理化性質(zhì)。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

將鑒定得到的基因核酸序列轉(zhuǎn)化成蛋白序列，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法Neighbor-Joining（參數(shù)：Poisson mode，Complete deletion，Bootstrap=1?000）進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，隨后利用Web CD-Search Tool（https://www.ncbi.nlm.nih.gov /Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）工具（參數(shù)：Search against database=Pfam-17919 PSSMs，其余參數(shù)為默認(rèn)值）對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，最后利用Evolview（https://www.evolgenius. info/evolview）對(duì)數(shù)據(jù)可視化處理。

1.5 ATS家族成員組織表達(dá)模式分析

從TPIA茶樹數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站中下載茶樹品種舒茶早基因在不同組織中表達(dá)量數(shù)據(jù)包（Eight_Tissues_TPM.txt.gz），并從中提取茶樹家族成員的表達(dá)量數(shù)據(jù)；從TomExpress（http://tomexpress.toulouse.inra.fr）[26]中下載番茄家族成員的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用TBtool和Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

1.6 ATS的定量PCR測(cè)定

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

顯著性檢驗(yàn)采用SAS9.4 M3（SAS Institute Inc，USA）中檢驗(yàn)（*<0.05，**<0.01）和鄧肯多重比較，文本和圖表中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n≥3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理組番茄葉片中乙胺、茶氨酸、丙氨酸及谷氨酰胺含量分析

番茄幼苗水培25?d后，以鮮重計(jì)，僅在處理組番茄葉片中檢測(cè)到(0.095?5±0.008?0)mg·g-1的乙胺和(0.017?0±0.003?5)mg·g-1的茶氨酸（圖2-C）。谷氨酸在處理組葉片中的含量極顯著降低（<0.01），僅為對(duì)照組的30%，變化趨勢(shì)與茶樹根和葉中類似（圖3-A），表明番茄體內(nèi)應(yīng)該存在ATS，可以將吸收的乙胺轉(zhuǎn)化成茶氨酸，且合成方式與茶樹相似。丙氨酸是茶樹合成乙胺的前體，它在茶樹根部的含量顯著低于葉片（圖3-A）；但在對(duì)照組和處理組番茄葉片中，丙氨酸含量差異不顯著（圖3-B），表明番茄體內(nèi)可能不存在類似于茶樹中的乙胺形成途徑，使得乙胺可能成為茶氨酸合成的關(guān)鍵限制因子。此外，與對(duì)照組相比，處理組番茄葉片中的谷氨酰胺含量提高了12.66倍，表明外源乙胺也增加了谷氨酰胺的合成量（圖4）。

表1 qRT-PCR 熒光定量引物序列

注：A為超高效液相色譜下乙胺、茶氨酸、谷氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間圖；B、C分別為對(duì)照組和處理組番茄葉片中乙胺和茶氨酸的出峰時(shí)間圖

注：A為龍井43一年生扦插苗根和葉片干重下的谷氨酸、丙氨酸、乙胺含量對(duì)比；B為處理組和對(duì)照組番茄葉片鮮重下的谷氨酸、丙氨酸、乙胺含量對(duì)比

圖4 乙胺處理下番茄葉中茶氨酸和谷氨酰胺的含量（鮮重）

2.2 ATS家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

在茶樹中共鑒定得到12個(gè)家族成員基因，其中的7個(gè)基因在文獻(xiàn)中已有注釋和命名，其余的5個(gè)，根據(jù)它們序列與茶樹和相似性依次命名為、、、、。在番茄基因組中共篩選到5個(gè)，其中將與高度相似的Solyc10g083830.2.1命名為，其余4個(gè)番茄的序列經(jīng)NCBI中的BLASTn檢索，分別注釋為、、、（表2）。

采用ExPaSy軟件對(duì)鑒定的家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析，茶樹與番茄的基因CDS編碼序列為597~2?562?bp，編碼198~853個(gè)氨基酸殘基，分子量為21.51~94.97?kDa，等電點(diǎn)pI為5.43~7.69，不穩(wěn)定指數(shù)為36.34~46.05，脂肪指數(shù)為73.53~96.06，親水性系數(shù)為–0.470~–0.040。其中茶樹與番茄GS基因的理化性質(zhì)較為一致，而與之間的理化性質(zhì)有所不同。除了CsTSI-3為堿性蛋白外，其余均為酸性蛋白。CsTSI、SlTSI不穩(wěn)定指數(shù)小于40，脂肪指數(shù)大于GS成員，表明CsTSI、SlTSI蛋白整體上要比GS穩(wěn)定。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為了進(jìn)一步明確ATS的同源關(guān)系，將篩選得到的茶樹與番茄ATS氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并構(gòu)建了茶樹和番茄ATS的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果表明，ATS家族被分為3個(gè)亞族，Ⅰ亞族中包含11個(gè)茶樹與番茄的GS1成員，Ⅱ中是CsGS2和SlGS2，Ⅲ中是4個(gè)TSI成員，因此將Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別注解為GS1、GS2和TSI簇。隨后利用Web CD-Search Tool對(duì)不同亞族的蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，共得到6個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，即谷氨酰胺合成酶催化域Gln-synt_C（PF00120），谷氨酰胺合成酶N端結(jié)構(gòu)域Gln-synt_N（PF03951）和Gln-synt_N_2（PF16952），氨基水解酶結(jié)構(gòu)域Amidohydro_2（PF04909），Cornichon（PF03311）和具有DNase活性的蛋白結(jié)構(gòu)域TatD_DNase（PF01026）。其中谷氨酰胺合成酶催化域Gln-synt_C是ATS家族成員所共有，也是谷氨酰胺合成酶行使功能的關(guān)鍵domain位點(diǎn)，表明ATS可能屬于谷氨酰胺合成酶家族。與Ⅰ、Ⅱ簇中的GS1、GS2相比，Ⅲ簇中的TSI還含有Gln-synt_N_2、Amidohydro_2、Cornichon及TatD_DNase等結(jié)構(gòu)域（圖5）。

表2 茶樹及番茄ATS基因家族理化性質(zhì)

圖5 茶樹及番茄ATS的系統(tǒng)進(jìn)化樹及保守結(jié)構(gòu)域

2.4 ATS家族成員組織表達(dá)模式分析

由于從茶樹基因表達(dá)數(shù)據(jù)中只獲取了、、、和等6個(gè)茶樹家族成員的表達(dá)量數(shù)據(jù)，因此對(duì)這部分的成員進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有組織中的和表達(dá)量均較低，其余4個(gè)基因在組織間存在表達(dá)差異。在根中表達(dá)量最高，成熟葉次之，在其他組織都有不同程度的表達(dá)；在花中表達(dá)最高，根和頂芽次之；在嫩葉、成熟葉和老葉中的表達(dá)相對(duì)較高，只在根中特異性表達(dá)（圖6）。

在TomExpress中未獲得番茄家族成員的表達(dá)量數(shù)據(jù)，其余4個(gè)基因和在不同樣本中的表達(dá)量存在較大差異。在不同生長(zhǎng)期的所有組織中，的表達(dá)量均最高，的表達(dá)量最低接近于0；而和在根、葉、花和籽粒中有一定的表達(dá)量（圖7）。

2.5 番茄ATS在乙胺處理下的基因表達(dá)分析

為了進(jìn)一步研究番茄在茶氨酸合成中的作用，在外源乙胺處理25?d后，對(duì)表達(dá)量較高的和進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果顯示，對(duì)照組中的表達(dá)量最高，與的表達(dá)量相近；而在處理組中，的表達(dá)量最高，次之，與對(duì)照組相比分別提高了19.5倍和4.1倍，最低且和對(duì)照組基本相同（圖8）。這表明和對(duì)外源乙胺的誘導(dǎo)敏感，可能在番茄葉部的茶氨酸合成中發(fā)揮了作用。

圖6 茶樹ATS基因家族在茶樹組織中的表達(dá)

圖7 番茄ATS基因家族在番茄不同生長(zhǎng)期組織中的表達(dá)

圖8 乙胺處理下番茄葉中ATS的表達(dá)水平

3 討論

3.1 ATS廣泛存在于植物的谷氨酰胺合成酶家族中

本研究通過對(duì)水培番茄幼苗進(jìn)行外源乙胺處理。發(fā)現(xiàn)僅在處理組葉片中檢測(cè)到茶氨酸的存在，并且在茶氨酸積累的同時(shí)，谷氨酰胺含量也顯著增加；蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，從茶樹和番茄基因組中鑒定到的均含有谷氨酰胺合成酶的關(guān)鍵催化位點(diǎn)Gln-synt_C。這表明番茄體內(nèi)存在ATS，且應(yīng)該屬于谷氨酰胺合成酶家族。

Sasaoka等[27]將乙胺添加到豌豆種子的丙酮粉提取物中，發(fā)現(xiàn)有茶氨酸的生成，推測(cè)這個(gè)過程可能是TS的非特異性反應(yīng)。Okada等[12]通過原核表達(dá)技術(shù)證實(shí)具有合成茶氨酸的能力，Deng等[13]和陳琪等[28]對(duì)上述兩個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們與GS基因序列高度相似。Cheng等[8]試驗(yàn)證實(shí)，擬南芥的谷氨酰胺合成酶基因和能夠催化乙胺和谷氨酸生成茶氨酸。Fu等[16]研究表明，茶樹谷氨酰胺合成酶基因、和分別在煙草中過表達(dá)能夠提高茶氨酸的合成量（≤0.05）。目前的文獻(xiàn)表明，在用乙胺培養(yǎng)過的豌豆、擬南芥、玉米和煙草等植物的組織中都能檢測(cè)到茶氨酸[8-9,16,27]。因此，推斷植物中應(yīng)該廣泛存在ATS，且該酶屬于植物的谷氨酰胺合成酶家族。

3.2 乙胺是合成茶氨酸的關(guān)鍵限制因子

已有研究表明，與茶氨酸生物合成過程相關(guān)的酶有谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAOT）GGT、丙氨酸脫羧酶（Alanine decarboxylase，AlaDC）和TS等[29-30]。此外，Dong等[31]證實(shí)有6個(gè)茶樹氨基酸通透酶CsAAP具有轉(zhuǎn)運(yùn)茶氨酸能力，其中CsAAP1可能主要介導(dǎo)了茶氨酸從根部到莖部的轉(zhuǎn)運(yùn)。AAP屬于氨基酸/生長(zhǎng)素滲透酶家族AAAPs并廣泛存在植物中[32-33]。Zhang等[34]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子TF家族中的MYB和bHLH可能調(diào)控了茶氨酸的形成，而MYB和bHLH在植物葉中普遍存在，其中在擬南芥中有超過100個(gè)成員[35]。盡管上述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和TF對(duì)茶氨酸合成有一定的作用，但它們是植物中比較常見的調(diào)控、轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，更多是對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的二次分配。

本研究結(jié)果表明，受到外源乙胺誘導(dǎo)后，番茄體內(nèi)的表達(dá)量相比于對(duì)照組有很大程度的提高，導(dǎo)致了茶氨酸的合成與積累。表明乙胺作為茶氨酸的前體物質(zhì)，可以誘導(dǎo)表達(dá)，觸發(fā)茶氨酸的合成。Wei等[9]曾用乙胺水溶液水培茶苗12?d后，發(fā)現(xiàn)根中的表達(dá)升高到最高水平，同時(shí)茶氨酸積累量也上升到峰值，認(rèn)為乙胺具有激活茶氨酸代謝途徑的作用。但本研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，番茄葉中的丙氨酸含量并沒有顯著變化，這說明番茄只能利用外源的乙胺來合成茶氨酸，自身并不能利用丙氨酸合成乙胺。乙胺在植物中的分布與茶氨酸相似，主要存在于茶樹中，且在已發(fā)現(xiàn)含有茶氨酸的物種中都有乙胺的存在[7-8]。而催化丙氨酸脫羧生成乙胺的關(guān)鍵酶是AlaDC，目前僅在茶樹中有報(bào)道[36]。之前文獻(xiàn)表明，只有經(jīng)過乙胺處理過的豌豆、擬南芥、玉米和煙草才能在體內(nèi)合成出茶氨酸[8-9,16-27]。綜上，我們認(rèn)為乙胺是制約植物合成茶氨酸的關(guān)鍵限制因子，且對(duì)茶氨酸的合成存在底物誘導(dǎo)效應(yīng)。

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Identification and Analysis of Analogue Theanine Synthase Gene Family in Tomato

MAO Peng1,2, WANG Liyuan1*, BAI Peixian1, WEI Kang1, RUAN Li1, ZHNAG Yazhen1, CHENG Hao1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Theanine synthetase (TS) and some members of the glutamine synthetase (GS) family in tea plants show catalytic activity for the synthesis of theanine from ethylamine and glutamic acid. The enzymes in plants that show catalytic activity for the synthesis of theanine and are highly similar to TS sequence of tea plants are named as the analogue theanine synthase (ATS). To explore the existence of ATS in non-tea plants and effect of ethylamine on theanine synthesis, ‘Mico-Tom’ tomato was used as materials. As tomato seedlings was treated hydroponically with ethylamine, theanine was successfully detected in the leaves of the treated group. The content of glutamine (Gln) in the tomato leaves was also significantly increased, while the content of alanine did not change compared with the control group. Then, 12 and 5 members of thefamily were identified respectively in tea and tomato through bioinformatics analysis and all of them contained the Gln-synt_C domain of glutamine synthase. Further qRT-PCR results show that the expressions of 2(and) in the leaves were significantly increased under the treatment of ethylamine. In conclusion, the ATS may exist widely in plants, and ethylamine would be a key limiting factor in the synthesis of theanine as an important precursor. Meanwhile, ethylamine can greatly accelerate the production of theanine by promoting the transcripts of.

tomato, theanine, ethylamine, analogue theanine synthase, gene family

S571；Q52

A

1000-369X(2021)02-173-11

2021-01-06

2021-01-22

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項(xiàng)（2016C02053）

毛鵬，男，碩士研究生，主要從事茶樹資源與育種研究。*通信作者：wangly@tricaas.com；chenghao@tricaas.com

（責(zé)任編輯：黃晨）