徐 飛，鄭澤航，徐漢青，楊 卿

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院骨科，湖北省武漢市430030)

隨著中國老齡化社會的進(jìn)展，衰老相關(guān)性研究逐漸成為熱點。人體骨骼也會隨著年齡的增長而發(fā)生衰老，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cell，BMSC)的衰老對骨骼系統(tǒng)的衰老起著至關(guān)重要的作用。研究衰老BMSC的特性及生物學(xué)功能需要大量的衰老細(xì)胞，而衰老細(xì)胞的增殖能力較差，無法通過傳統(tǒng)的傳代培養(yǎng)方法來快速獲取足量的細(xì)胞。現(xiàn)階段獲取衰老BMSC的方法主要有以下幾種：①直接從衰老個體的骨髓中分離提取衰老的間充質(zhì)干細(xì)胞，但高齡小鼠比較難獲得，且分離提取的細(xì)胞量較少，難以進(jìn)行細(xì)胞擴增；②分離培養(yǎng)正常的BMSC，經(jīng)過體外培養(yǎng)與傳代處理獲得自然衰老的BMSC，但此過程時間較長，通常需要多次傳代培養(yǎng)[1]；③通過化學(xué)與射線照射等方法造成細(xì)胞DNA損傷，獲得衰老的BMSC模型[2]。

為了建立一種快速、有效且穩(wěn)定的獲得小鼠衰老BMSC的方法，本文根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及前期預(yù)實驗[3-5]，采用200 μmol/L過氧化氫(H2O2)處理正常的小鼠BMSC 2 h[5]，處理完畢后，檢測相關(guān)衰老指標(biāo)來確認(rèn)所獲得的細(xì)胞為衰老的BMSC，以期建立一種快速有效且穩(wěn)定的衰老BMSC模型。

1 材料和方法

1.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

取3周齡C57BL/6小鼠(華中科技大學(xué)實驗動物中心提供)，收集其雙側(cè)股骨與脛骨，取髓腔內(nèi)細(xì)胞全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，獲得BMSC，具體分離培養(yǎng)及鑒定方法參考文獻(xiàn)[6]。

1.2 H2O2誘導(dǎo)衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞模型

取所分離的第3代小鼠BMSC，以1×104個/cm2細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含5 mL完全培養(yǎng)基[α-MEM(Hyclone公司，美國)，10%胎牛血清(Gibico公司，美國)，1%抗生素]。對照組加入1 μL PBS(Hyclone公司，美國)；造模組加入1 μL H2O2(Sigma公司，美國)，其終濃度為200 μmol/L，兩組細(xì)胞均處理2 h，處理結(jié)束后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線的繪制

將兩組細(xì)胞以1×104個/cm2接種于96孔板，每孔150 μL，每天同一時間點取出96孔板，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)(Invitrogen公司，美國)，培養(yǎng)4 h后，去上清加入DMSO測定各孔光密度(490 nm)，共測定7天，以此繪制時間光密度BMSC生長曲線。

1.4 SA-β-gal染色

將兩組細(xì)胞以1×104個/cm2接種于48孔板，細(xì)胞完全貼壁后，進(jìn)行衰老表型β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase，SA-β-gal)染色(Solarbio公司，中國)，衰老的BMSC于鏡下呈藍(lán)色。SA-β-gal陽性細(xì)胞的計算：每組鏡下隨機視野計數(shù)100個細(xì)胞，統(tǒng)計出SA-β-gal陽性細(xì)胞個數(shù)，并計算百分比。

1.5 端粒功能失調(diào)誘導(dǎo)病灶分析

將兩組細(xì)胞以1×104個/cm2接種于12孔板(Corning公司，美國)，每孔里放置圓形載玻片，讓細(xì)胞貼于載玻片上生長，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行端粒功能失調(diào)誘導(dǎo)病灶(telomere dysfunction-induced foci，TIF)分析。簡要操作如下：4%多聚甲醛(Sigma公司，美國)室溫固定后，加入1%Triton-X100(Sigma公司，美國)通透細(xì)胞；10% BSA(Abcam公司，美國)封閉后加一抗53BP1(Abcam公司，美國)和γH2AX(Abcam公司，美國)雙染；熒光二抗(Abcam公司，美國)染色后，DAPI(Invitrogen公司，美國)染核。封片，然后共聚焦顯微鏡(Cell insight CX5，Thermo Fisher,美國)下觀察并拍照。TIF陽性細(xì)胞的計算：以53BP1和γH2AX共定位的點代表TIF，每組計數(shù)50個細(xì)胞，每個細(xì)胞存在53BP1和γH2AX共定位的點(顯示為黃色點)即認(rèn)為是TIF陽性細(xì)胞，統(tǒng)計兩組陽性細(xì)胞百分比。

1.6 RNA提取與基因表達(dá)分析

將兩組細(xì)胞分別取1×106個進(jìn)行RNA提取操作，具體如下：每組細(xì)胞加入0.5 mL TRIZOL(Invitrogen公司，美國)進(jìn)行充分裂解后，加入0.1 mL三氯甲烷，孵育完成后進(jìn)行離心，細(xì)胞RNA位于上清中，吸取上清液，加入等量異丙醇，進(jìn)行離心操作，RNA位于EP管的底部，吸去上清后以75%乙醇洗滌，并調(diào)整兩組總RNA至同一濃度。將所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR分析兩組細(xì)胞衰老相關(guān)基因p16、p21、p53的表達(dá)情況。所用引物序列見表1。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

表1 Real-time PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 兩組BMSC生長情況的比較

細(xì)胞生長曲線如圖1所示，造模組BMSC生長明顯較對照組緩慢(P<0.05)。

圖1 兩組BMSC生長情況的比較a為P<0.05，與對照組比較。

2.2 兩組BMSC SA-β-gal陽性細(xì)胞的比較

造模組BMSC的SA-β-gal酶活性增強，SA-β-gal陽性細(xì)胞(染色呈藍(lán)色)較對照組多(圖2A)。造模組SA-β-gal陽性細(xì)胞比例明顯高于對照組(P<0.05；圖2B)。

圖2 兩組BMSC SA-β-gal陽性細(xì)胞的比較A為SA-β-gal染色結(jié)果(200×)，藍(lán)色為SA-β-gal陽性細(xì)胞；B為SA-β-gal陽性細(xì)胞直方圖。

2.3 兩組BMSC TIF陽性細(xì)胞的比較

造模組BMSC TIF陽性細(xì)胞較對照組多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖3)。

圖3 兩組BMSC TIF陽性細(xì)胞的比較A為TIF染色結(jié)果(200×)，造模組BMSC存在53BP1/γH2AX共定位點的陽性細(xì)胞(白色箭頭所示)；B為BMSC TIF陽性細(xì)胞直方圖。

2.4 兩組BMSC p16、p21和p53基因表達(dá)的比較

與對照組比較，造模組p16、p21和p53表達(dá)均明顯增加(P<0.01，P<0.05；圖4)。

圖4 兩組BMSC p16、p21和p53基因表達(dá)的比較

3 討 論

細(xì)胞與機體的衰老是生命的基本現(xiàn)象。通過體內(nèi)或體外的反復(fù)細(xì)胞分裂，獲得衰老細(xì)胞的方式耗時耗力且量少。本研究通過H2O2的誘導(dǎo)處理，正常的BMSC發(fā)生DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞衰老[7]。衰老的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞生長緩慢，SA-β-gal染色陽性，端粒功能障礙誘導(dǎo)的損傷灶(TIF)陽性及相關(guān)衰老基因p16、p21、p53表達(dá)增加。本研究以此得到的衰老細(xì)胞模型有效且快速。

H2O2誘導(dǎo)處理正常的BMSC后，細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量聚集，ROS可引發(fā)DNA損傷，蛋白質(zhì)氧化損傷，形成蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合物等，通過相關(guān)細(xì)胞通路阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，使細(xì)胞生長緩慢甚至停滯[8]。

SA-β-gal作為特異性衰老細(xì)胞的標(biāo)志物最早在1995年被Dimir等[9]提出，他們觀察到在pH為6.0時，僅有衰老的細(xì)胞為β-gal染色陽性，其原因為衰老細(xì)胞的內(nèi)源性溶酶體-半乳糖的過度表達(dá)和積累。

端粒的主要功能是保持染色體完整性，可保護DNA免受DNA雙鏈斷裂影響。ROS可引起端粒功能障礙，DNA損傷反應(yīng)。持續(xù)的DNA損傷應(yīng)答，可導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯，發(fā)生細(xì)胞衰老。當(dāng)DNA損傷時，H2AX發(fā)生磷酸化，募集DNA修復(fù)蛋白進(jìn)行DNA修復(fù)。γH2AX與53BP1等復(fù)合體共定位于DNA損傷處進(jìn)行應(yīng)答反應(yīng)，使細(xì)胞進(jìn)入生長停滯，并可能啟動衰老程序[10-11]。因此，通過尋找細(xì)胞內(nèi)53BP1和γH2AX共定位的點可以辨別衰老細(xì)胞。

氧化應(yīng)激使得細(xì)胞p16、p21、p53基因表達(dá)增加。p16、p21、p53在細(xì)胞衰老和細(xì)胞周期中起關(guān)鍵調(diào)控作用[12-13]。p16表達(dá)增加可阻止細(xì)胞周期通過G1/S檢測點使得細(xì)胞生長停滯；與此同時，p53的上調(diào)可激活p21基因，抑制cyclinA/E-CDK2的活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行[14-15]。

劉洋等[3]為建立人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老模型，采用H2O2來誘導(dǎo)處理，成功地得到了衰老模型，其H2O2處理濃度和時間與本研究相同。與之不同，郭柏銘等[4]也采用了H2O2誘導(dǎo)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的方法成功地獲得了衰老模型，但其處理方法為500 μmol/L H2O2處理24 h，其可能原因為所處理的細(xì)胞不同，郭柏銘等[4]所得到的是衰老的大鼠BMSC，而本研究為小鼠BMSC。

綜上所述，通過200 μmol/L H2O2處理小鼠BMSC 2 h，可獲得較好的細(xì)胞衰老模型，此模型細(xì)胞生長慢，SA-β-gal染色陽性率高，TIF陽性細(xì)胞多，且p16、p21和p53基因的表達(dá)明顯增高，可用于衰老BMSC相關(guān)實驗研究。