賈 燕，曹金山，魏戰(zhàn)勇

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

氨基肽酶N（aminopeptidase N，APN）是一種大小為150 kDa 且高度糖基化的膜結(jié)合Ⅱ型鋅金屬跨膜蛋白酶，主要分布在腸道上皮絨毛細(xì)胞中。APN 生理功能為消化肽鏈， 使多肽在小腸中消化， 并與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及多種冠狀病毒的黏附作用有關(guān)［1-2］。 豬氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N，pAPN）由963 個(gè)氨基酸編碼，在多種上皮細(xì)胞和組織中分布， 尤其在小腸刷狀緣高效表達(dá)［3-4］。pAPN 在胰蛋白酶的作用下可分解為2 個(gè)亞基，分別是95 kDa 的N 端和50 kDa 的C 端［2］。 有研究表明pAPN 可能是多種豬腸道冠狀病毒在感染宿主時(shí)的侵入受體。 豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV） 是最先被鑒定出以pAPN 作為關(guān)鍵性受體的豬腸道冠狀病毒，并以Ser-506 至Ile-728 位氨基酸與pAPN 的第717～813 位氨基酸在感染過程中進(jìn)行特異性結(jié)合［5-6］。 豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV） 與TGEV 同屬α-冠狀病毒屬，有學(xué)者證明pAPN 與PEDV S1 的C 末端可以相互作用， 也有較多研究顯示pAPN 與PEDV 沒有直接關(guān)系［7-9］。 豬德爾塔冠狀病毒 （porcine delta coronavirus，PDCoV） 是引起豬腸道疾病的丁型冠狀病毒，其S1 亞基結(jié)構(gòu)域B 與pAPN 存在相互作用［10］。 豬腸道甲型冠狀病毒（swine enteric alphacoronavirus，SeACoV）是近年發(fā)現(xiàn)的豬腸道冠狀病毒， 已有研究報(bào)道豬腸道甲型冠狀病毒不以常見的其他豬腸道冠狀病毒的受體為功能性受體，但也沒有明確指出使用哪種受體侵入宿主細(xì)胞［4］。APN 在不同物種間保守性較高， 不同冠狀病毒利用APN 作為主要感染性受體或者輔助功能性受體，可能更便于跨種屬傳播。還有一些冠狀病毒可能使用APN 作為受體，也可能以多種方式感染宿主，感染機(jī)制尚不清楚。該研究利用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)pAPN 的生物學(xué)功能及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測分析。 為深入研究pAPN 生物學(xué)過程及特異性功能域提供背景知識(shí)， 尋找pAPN 與相關(guān)病毒進(jìn)行互作的結(jié)合位點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 基因序列及氨基酸序列

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取pAPN 核苷酸數(shù)據(jù)（ID：HQ824547）；從Uniprot 數(shù)據(jù)庫獲得pAPN 蛋白氨基酸序列及protein accession：ADX53333.1。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用pAPN 蛋白序列進(jìn)行以下生物學(xué)分析，利 用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析pAPN 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)； 利用ExPASy-ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/） 分 析pAPN 蛋白質(zhì)親疏水性； 利用SingalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/） 預(yù) 測pAPN蛋白質(zhì)信號(hào)肽序列； 利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 分 析pAPN 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；通過NetNGlyc 4.0 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/） 預(yù) 測pAPN 蛋白質(zhì)N 型糖基化位點(diǎn)； 使用Predicting Antigenic Peptides （http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl） 預(yù)測pAPN 蛋白質(zhì)抗原表位； 利用SMART （http：//smart.embl-heidelberg.de/） 預(yù) 測pAPN 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域； 利用Python molecule（Py-MOL）觀察pAPN 蛋白質(zhì)空間三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 pAPN 蛋白理化性質(zhì)分析

將pAPN 氨基酸序列（ADX53333.1） 上傳到ProtParam 在線軟件分析框， 點(diǎn)擊計(jì)算參數(shù)（compute parameters）。 pAPN 蛋白可編碼963 個(gè)氨基酸， 分子量和等電點(diǎn)分別為108 885.20 Da 和5.09。 該蛋白質(zhì)包含106 個(gè)帶負(fù)電荷的殘基和73個(gè)帶正電荷的殘基；pAPN 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為37.14， 脂肪族氨基酸指數(shù)為87.51， 平均疏水性為-0.236。 pAPN 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果見表1。

表1 pAPN 蛋白理化性質(zhì)分析

2.2 pAPN 蛋白疏水性分析

通過ExPASy-ProtScale 軟件對(duì)pAPN 氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析，分析結(jié)果依據(jù)正值代表疏水性，負(fù)值表示親水性的規(guī)律呈現(xiàn)。 ProtScale 查詢結(jié)果可用數(shù)值格式（numerical format）或者圖表格式（image in GIF-format）分別展現(xiàn)每個(gè)氨基酸的親疏水性具體數(shù)值。 如圖1 所示， 利用image in GIF-for mat 說明pAPN 的第963 位氨基酸整體親疏水性分布情況。 第17 位亮氨酸（Leu）數(shù)值最大為2.844，證明該位氨基酸疏水性最強(qiáng)，第39 位賴氨酸（Lys）數(shù)值最小為-2.967， 證明該位氨基酸親水性最強(qiáng)。由此得知，pAPN 屬于不穩(wěn)定的可溶性蛋白質(zhì)。

2.3 pAPN 蛋白信號(hào)肽分析

信號(hào)肽是由長度為5～30 個(gè)疏水性氨基酸組成，可引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移，通常位于氨基酸序列的N 端。 信號(hào)肽的作用是促進(jìn)蛋白分泌到胞外，主要存在于分泌蛋白、跨膜蛋白和真核生物細(xì)胞器內(nèi)。在進(jìn)行重組蛋白表達(dá)前，需要對(duì)氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測。 運(yùn)用SingalP 4.0在線軟件預(yù)測pAPN 蛋白顯示不含有信號(hào)肽序列，在后續(xù)載體構(gòu)建過程中可以加上一段信號(hào)肽，以增加分泌蛋白的表達(dá)量，見圖2。

2.4 pAPN 蛋白跨膜區(qū)分析

TMHMM 是基于馬爾可夫模型并結(jié)合跨膜區(qū)疏水性、螺旋長度、電荷偏倚和膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)限制等性質(zhì)預(yù)測跨膜螺旋的程序， 可對(duì)跨膜區(qū)及膜內(nèi)外區(qū)進(jìn)行整體預(yù)測。 TMHMM Server v.2.0 對(duì)pAPN氨基酸序列（ADX53333.1）預(yù)測結(jié)果如圖3 所示，紫色線條表示第35～963 位氨基酸在胞外的概率，紅色區(qū)域表示第12～34 位氨基酸之間可形成典型的跨膜螺旋區(qū)， 表明pAPN 蛋白主要分布于細(xì)胞膜，且可能作為病毒侵入細(xì)胞的膜受體。

圖1 pAPN 蛋白親疏水性分析

圖2 pAPN 蛋白信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果

圖3 pAPN 蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析

2.5 預(yù)測pAPN 蛋白糖基化位點(diǎn)

糖基化修飾可對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括酰胺鏈連接的糖鏈（N-糖基化） 和羥基連接的糖鏈（O-糖基化）。 利用NetNGlyc 4.0 Serve/NetOGlyc 4.0 Serve 在線軟件對(duì)pAPN 進(jìn)行N 型和O 型糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測。 預(yù)測結(jié)果顯示，pAPN 含有11 個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)，分別位于第49、50、52、54、55、56、60、64、447、451、452 位氨基酸。 同時(shí)pAPN 含有12 個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)， 分別位于第229、237、258、286、314、328、506、556、569、622、646、736位氨基酸。 打分平均值在0.5 以上（見圖4、圖5）。在線數(shù)據(jù)庫查詢和在線軟件預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.6 預(yù)測pAPN 蛋白抗原表位

蛋白質(zhì)的特異性取決于抗原決定簇， 即由抗原決定簇的種類、性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)型決定與什么抗體或者受體進(jìn)行特異性結(jié)合， 從而完成病毒的生命活動(dòng)。 利用predicting antigenic peptides 在線軟件對(duì)pAPN 進(jìn)行抗原決定簇預(yù)測。 結(jié)果顯示，pAPN 擁有42 個(gè)抗原決定簇（見圖6、圖7），圖7中紅色部分即為抗原表位可能出現(xiàn)的區(qū)域。

2.7 預(yù)測pAPN 蛋白結(jié)構(gòu)域

圖4 pAPN 蛋白糖基化位點(diǎn)分析

圖5 pAPN 蛋白單體糖基化位點(diǎn)

通過簡單模塊構(gòu)架搜索工具分析，發(fā)現(xiàn)pAPN含有2 個(gè)典型的功能結(jié)構(gòu)域， 分別是第291～539位氨基酸高度保守的功能域peptidase_M1 和第616～943 位是高度保守的結(jié)構(gòu)功能域內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基肽酶 （endoplasmic reticulum aminopeptidase1，ERAP1）_C（見圖8）。

2.8 pAPN 空間結(jié)構(gòu)

圖6 pAPN 蛋白抗原表位分析

圖7 pAPN 蛋白單體抗原表位

圖8 pAPN 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

圖9 pAPN 蛋白二聚體空間結(jié)構(gòu)

pAPN 胞外區(qū)以二聚體形式發(fā)揮生物學(xué)功能，每個(gè)單體都可被分為4 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域， 分別命名為Ⅰ～Ⅳ。 并通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）下 載pAPN（PDB ID code 5LDS）［10-12］，運(yùn) 用PyMOL 顯示pAPN 二聚體的空間結(jié)構(gòu) （見圖9），并對(duì)pAPN （protein accession：ADX53333.1） 使用SWISS-MODEL 進(jìn)行單體空間結(jié)構(gòu)域預(yù)測， 預(yù)測結(jié)果顯示與5LDS 相似度高達(dá)99.14%。 已有研究報(bào)道了pAPN 單體空間三維結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域Ⅰ為35～281 位氨基酸，由15 鏈β 桶狀折疊組成，用豆青色表示。 第282～543 位氨基酸為結(jié)構(gòu)域Ⅱ，包含2 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域：N 末端亞結(jié)構(gòu)域（殘基282～369）由5 鏈β折疊連接1 個(gè)α 螺旋組成；C 末端亞結(jié)構(gòu)域（殘基370～543）包含7 個(gè)α 螺旋超螺旋，用粉紫色表示。結(jié)構(gòu)域Ⅲ為第544～632 位氨基酸， 采用7 鏈β 夾心折疊構(gòu)成，用青紫色表示。 結(jié)構(gòu)域Ⅳ為第633～963 位氨基酸包含16 個(gè)α 螺旋超螺旋，用綠色表示［4，12］。 pAPN 在總體結(jié)構(gòu)域排列和結(jié)構(gòu)域折疊方面與其他M1 家族金屬酶非常匹配。

3 討論

目前， 冠狀病毒對(duì)全球畜牧業(yè)的危害日益嚴(yán)重， 對(duì)于引起豬腸道疾病的豬腸道冠狀病毒是如何利用侵入受體的研究是目前急需解決的基礎(chǔ)科學(xué)問題。 研究結(jié)果中對(duì)不同豬腸道冠狀病毒的感染性受體的差異， 使得學(xué)者們對(duì)pAPN 這個(gè)經(jīng)常被用來作為冠狀病毒進(jìn)入宿主易感細(xì)胞的主要受體產(chǎn)生較多關(guān)注［13-14］。pAPN 又名CD13，是金屬蛋白酶家族中一種分子量約為150 kDa 的Ⅱ型跨膜蛋白。 Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型跨膜蛋白均屬于單程分子，而Ⅳ型為多程分子。 Ⅰ型通過終止轉(zhuǎn)移錨序列錨定在脂質(zhì)膜上。Ⅱ型和Ⅲ型以信號(hào)錨序列錨定，Ⅱ型以其C 端結(jié)構(gòu)域靶向ER 管腔， 而Ⅲ型的N 端結(jié)構(gòu)域以ER 管腔為靶。 Ⅳ型又分為Ⅳ-A、Ⅳ-B 兩型， 分別以其N 端結(jié)構(gòu)域靶向細(xì)胞溶質(zhì)和靶向內(nèi)腔。pAPN 分布于多種細(xì)胞表面尤其在腸道上皮細(xì)胞表達(dá)水平相對(duì)較高。由此推斷，該蛋白生物學(xué)功能較廣泛， 可借助其N 端的螺旋產(chǎn)生跨膜方式進(jìn)入細(xì)胞膜。 在其膜結(jié)合形式中參與了細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜功能，如肽裂解、免疫細(xì)胞趨化。 同時(shí)也與多種冠狀病毒的黏附與侵襲有關(guān)［1-4］。

對(duì)冠狀病毒功能性受體的研究一直是病毒學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 作為冠狀病毒常見受體的pAPN 經(jīng)常被用來做細(xì)胞試驗(yàn)，研究病毒感染機(jī)制。研究最早的冠狀病毒是TGEV， 利用抗細(xì)胞受體法證明了pAPN 是TGEV 的感染性受體［5］。與TGEV 同屬甲型冠狀病毒的PEDV 與宿主受體互作的具體位置以及關(guān)鍵受體的研究有很多， 如Li 等［15］用PEDV 感染pAPN 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染于敲除掉pAPN 的豬睪丸細(xì)胞和犬腎上皮連續(xù)細(xì)胞系（madin-daby canine kidney cells）MDCK 后， 發(fā)現(xiàn)pAPN 的有無對(duì)PEDV 感染這些細(xì)胞系沒有影響。 Shirato 等［16］和Cui 等［17］證明了可溶性pAPN 不能中和PEDV 對(duì)Vero 細(xì)胞的感染，其他手段得出同樣的結(jié)論。利用PDCoV 棘突蛋白S1 與內(nèi)源性表達(dá)pAPN、過表達(dá)pAPN 及敲除pAPN 的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合后再感染試驗(yàn)，證明pPAN 可以介導(dǎo)PDCoV 感染宿主細(xì)胞［18］。同年Zhu 等［19］、Li 等［15］報(bào)道PDCoV S1 可以與pAPN 發(fā)生特異性結(jié)合的結(jié)論。 可見，繼續(xù)深入研究豬腹瀉相關(guān)病毒的致病機(jī)理為早日攻克豬腸道疾病有重要意義。 作為目前受關(guān)注度較高的冠狀病毒功能性受體pAPN，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)的精確解析也可為研究其功能提供幫助。

通過生物信息學(xué)軟件分析得知pAPN 屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白酶且無信號(hào)肽，但有文獻(xiàn)報(bào)道該蛋白含有信號(hào)肽［20］。 在第35～963 位氨基酸形成胞外蛋白，第12～34 位氨基酸形成典型的跨膜螺旋區(qū)， 表明該蛋白為細(xì)胞膜蛋白。 pAPN 擁有23 個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)、42 個(gè)抗原表位。 功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示pAPN 含有peptidase_M1 和ERAP1_C 兩個(gè)典型的功能結(jié)構(gòu)域，以上生物學(xué)分析與 劉 穎 等［21］對(duì)pAPN 預(yù) 測 結(jié) 果 基 本 一 致。 運(yùn) 用PyMOL 可視化軟件顯示pAPN 胞外域的空間三維結(jié)構(gòu)其中結(jié)構(gòu)域Ⅰ為35～281 位氨基酸， 由15鏈β 桶狀折疊組成，結(jié)構(gòu)域Ⅱ?yàn)?82～543 位氨基酸，包含N 末端和C 末端2 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，分別以5 鏈β 折疊連接1 個(gè)α 螺旋和7 個(gè)α 螺旋超螺旋構(gòu)成，第544～632 位氨基酸采用7 鏈β 夾心折疊構(gòu)成結(jié)構(gòu)域Ⅲ， 結(jié)構(gòu)域Ⅳ為633～963 位氨基酸，包含16 個(gè)α 螺旋超螺旋［10-11］。 pAPN 在總體結(jié)構(gòu)域排列和結(jié)構(gòu)域折疊方面與M1 家族其他金屬酶非常相似，空間三維結(jié)構(gòu)精確解析可為下一步尋找該蛋白與豬腸道冠狀病毒棘突蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)提供結(jié)構(gòu)方面素材， 為下一步研究pAPN 功能結(jié)構(gòu)域與豬腸道冠狀病毒膜蛋白相互作用提供理論依據(jù)。