陳振華,胡培磊,易松林,張小萍,段 潔,劉昭國,譚云洪
(湖南省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南 長沙 410013)
非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)是一種條件致病菌,對(duì)人的致病程度較結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)弱,但能引起多種疾病[1-2]。近年來,世界范圍內(nèi) NTM 感染并致病呈上升趨勢(shì),既有醫(yī)源性NTM感染的暴發(fā)流行,也有散發(fā)性NTM病,如NTM肺病(NTMPD)、NTM皮膚感染和可播散性NTM疾病,許多國家均有報(bào)道[1-4]。NTMPD的發(fā)病率逐年上升,其臨床癥狀、X線表現(xiàn)與肺結(jié)核相似,但治療方案差別明顯,臨床上多造成誤診、誤治,使得患者病程遷延。人們對(duì)NTMPD的認(rèn)識(shí)不斷加深,NTMPD診治上的困難及其帶來的危害已引起臨床醫(yī)生的高度重視[2,5-7]。本研究對(duì)2017—2019年湖南省胸科醫(yī)院培養(yǎng)分離的分枝桿菌臨床株進(jìn)行菌種鑒定,并對(duì)其中部分膿腫分枝桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)測(cè)試,分析NTM菌種分布及耐藥性,旨在為臨床診治NTMPD提供依據(jù)。
1.1 菌株來源 2017—2019年湖南省胸科醫(yī)院經(jīng)BACTEC MGIT 960 System(簡稱MGIT 960)培養(yǎng)陽性的10 443株非重復(fù)分枝桿菌臨床分離菌株。
1.2 主要試劑與儀器 羅氏(L-J)培養(yǎng)基 、對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基及噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基購于珠海貝索生物技術(shù)公司,MPB64抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)公司。lab-aid 824核酸提取儀及其配套試劑購于廈門致善生物科技公司。PCR反應(yīng)試劑購于北京全式金生物技術(shù)公司,引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增儀購自杭州博日科技公司??焖偕L分枝桿菌(rapidly growing mycobacteria,RGM)藥敏板購于賽默飛世爾科技公司。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株 MTB對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供,藥敏質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213、銅綠假單胞菌 ATCC 27853 購于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。
1.4 研究方法
1.4.1 分枝桿菌鑒定 MGIT 960培養(yǎng)報(bào)陽性菌株經(jīng)抗酸染色涂片、結(jié)核分枝桿菌抗原MPB64檢測(cè)、PNB培養(yǎng)基生長試驗(yàn)、TCH培養(yǎng)基生長試驗(yàn),鑒定出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)和NTM,試驗(yàn)操作及判讀標(biāo)準(zhǔn)均參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]進(jìn)行。見表1。
表1 分枝桿菌鑒定試驗(yàn) MTBC和NTM判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Judgement criteria of MTBC and NTM in Mycobacterium identification testing
1.4.2 NTM菌種鑒定
1.4.2.1 DNA提取 初步鑒定為NTM后,從L-J固體培養(yǎng)基斜面上刮取2接種環(huán)菌落重懸于生理鹽水中,使用lab-aid 824儀器提取DNA,上清用作基因測(cè)序模板液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 采用16S rRNA、Hsp65、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)三對(duì)引物擴(kuò)增,16S rRNA上游引物為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,下游引物為:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’;Hsp65上游引物為5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT’,下游引物為5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’;ITS上游引物為5’-AAGTCGTAACAAGGTARCCG-3’,下游引物為5’- TCGCCAAGGCATCCACC-3’。16S rRNA產(chǎn)物1 500 bp,Hsp65產(chǎn)物400 bp,ITS產(chǎn)物380 bp。PCR反應(yīng)體系30 μL:上下游引物各1 μL,2×Tag PCR Master Mix 15 μL,ddH2O 12 μL,DNA模板1 μL,同時(shí)取兩管PCR反應(yīng)管分別加入結(jié)核分枝桿菌陽性質(zhì)控品和結(jié)核分枝桿菌陰性質(zhì)控品。按如下程序擴(kuò)增:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸90 s,共25個(gè)循環(huán);72℃終延伸7 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖(含GelRed核酸染料)凝膠中電泳,觀察結(jié)果。
1.4.2.3 測(cè)序及同源性比對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,利用BLAST軟件將測(cè)序得到的基因序列與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)作同源性比較,相似度≥97%即可確定菌種。
1.4.3 藥敏試驗(yàn) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)《M24-A2指南》標(biāo)準(zhǔn)[9],采用RGM藥敏板檢測(cè)膿腫分枝桿菌10種抗菌藥物的MIC值,操作和結(jié)果判斷參照《M24-A2指南》和試劑盒說明書進(jìn)行。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Excle 2016軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.1 分枝桿菌鑒定結(jié)果 2017—2019年,MGIT 960培養(yǎng)報(bào)陽性的菌株數(shù)分別為3 342、3 535、3 566株,從中分別分離出NTM 371、403、453株,各年度檢出率分別為11.1%、11.4%、12.7%;共分離NTM 1 227株,總檢出率為11.7%。
2.2 NTM菌種鑒定結(jié)果 1 227株NTM中,經(jīng)測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定,剔除測(cè)序失敗的菌株,最終有1 189株確定菌種,居前四位的菌種分別是胞內(nèi)分枝桿菌(27.8%)、膿腫分枝桿菌(25.3%)、戈登分枝桿菌(16.5%)、鳥分枝桿菌(16.1%)。見表2。
表2 2017—2019年湖南省胸科醫(yī)院NTM菌種分布情況Table 2 Distribution of NTM species in Hunan Chest Hospital from 2017 to 2019
2.3 NTM藥敏試驗(yàn)結(jié)果 因條件限制,只對(duì)臨床診斷為NTMPD且病原菌為膿腫分枝桿菌的部分菌株的進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示,56株膿腫分枝桿菌對(duì)阿米卡星、克拉霉素和利奈唑胺的敏感性較高,敏感率分別為94.6%、87.5%、82.1%,對(duì)其他藥物的敏感率均低于50%。見表3。
表3 56株膿腫分枝桿菌對(duì)10種抗菌藥物的藥敏結(jié)果Table 3 Antimicrobial susceptibility testing result of 56 strains of Mycobacterium abscessus to 10 kinds of antimicrobial agents
我國歷次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查[10]結(jié)果顯示,NTM的檢出率持續(xù)增高。本研究結(jié)果顯示,2017—2019年該院NTM檢出率為11.7%,檢出率有逐年上升趨勢(shì),與其他國家報(bào)道[4,11]結(jié)果一致??赡茉蚴桥R床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰Σ粩嗵嵘?,尤其是免疫和分子生物技術(shù)的發(fā)展使更多的NTM被分離、鑒定出來;隨著老年人、慢性阻塞性肺疾病、惡性腫瘤、免疫抑制劑使用增多等導(dǎo)致NTM感染的人數(shù)越來越多[12]。
由于NTM病與結(jié)核病有相似的臨床癥狀,鑒別診斷困難[7,13]。NTM致病菌菌種繁多,不同菌種與疾病的相關(guān)性不同,不同菌種對(duì)抗菌藥物的敏感性也不同,增加了治療的難度[2,5,7],準(zhǔn)確地菌種鑒定是臨床正確診斷、有效治療的前提。本研究通過聯(lián)合分析16SrRNA、Hsp65、ITS同源序列組成差異,將NTM鑒定至種水平,結(jié)果顯示臨床分離的RGM主要是膿腫分枝桿菌,慢生長分枝桿菌(slowly growing mycobacteria, SGM)主要是胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌。不同類型的臨床標(biāo)本雖然都可分離獲得NTM,但以痰、支氣管肺泡灌洗液、肺活檢組織獲得NTM培養(yǎng)陽性的可能性最大[14-15]。肺部NTM感染最常見的菌種是鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合體(Mycobacterium avium-intracellulare complex,MAC)、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌。該院為結(jié)核病??漆t(yī)院,大部分患者有肺部疾病,且送檢標(biāo)本以痰居多,因此,該院分離的NTM也是以MAC和膿腫分枝桿菌為主,分布情況與國內(nèi)外報(bào)道結(jié)果基本相符,但在NTM菌種組成、構(gòu)成比上仍存在差異[4,16-18],進(jìn)一步證實(shí)NTM種屬分布常具有地域特點(diǎn),不同國家及不同地區(qū)菌種構(gòu)成不同。2017—2019年該院檢出的NTM中,RGM檢出率逐年上升,尤其是膿腫分枝桿菌上升較快,可能與該院大部分就診患者有肺部疾病,而膿腫分枝桿菌主要侵犯人體肺有關(guān)[1]。一般認(rèn)為,臨床標(biāo)本分離出戈登分枝桿菌很可能是標(biāo)本被污染且不致病[2],本研究分離的戈登分枝桿菌占比較高,是標(biāo)本污染菌還是病原菌,需進(jìn)一步深入研究確定。
本研究存在一定的局限性:目前賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)的藥敏板只適于RGM藥敏檢測(cè),所以,本研究未獲得湖南省SGM的藥敏結(jié)果;另外,RGM藥敏板2018年10月才獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)室2019年開展RGM藥敏檢測(cè),本研究的膿腫分枝桿菌數(shù)量少,藥敏結(jié)果可能存在偏倚,后續(xù)研究應(yīng)增加菌株數(shù),檢測(cè)其對(duì)10種抗菌藥物藥敏情況。