張 靖，馮曉杰，白惠娟

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)婦瘤科 鄭州 450008

卵巢癌是致命的婦科惡性腫瘤之一[1]。目前，卵巢癌治療主要采用手術(shù)聯(lián)合輔助化療等方法，但由于手術(shù)局限性、化療耐藥性以及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，晚期卵巢癌患者5 a生存率仍低于30%[2]。因此，了解卵巢癌的發(fā)病機制和分子改變對改善卵巢癌患者生存現(xiàn)狀具有重要意義。研究[3]表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)在細胞增殖和凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。lncRNA的表達異常與卵巢癌的進展有關(guān)。lncRNA生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5(GAS5)在卵巢癌中表達下調(diào)，GAS5表達降低可促進細胞增殖、遷移和侵襲，提示卵巢癌預(yù)后不良[4]；lncRNA 性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率族蛋白4(SOX4)在上皮性卵巢癌組織中表達上調(diào)，SOX4表達水平升高與腫瘤體積、腫瘤分級、轉(zhuǎn)移距離呈正相關(guān)[5]；lncRNA HOX基因的反義基因間RNA(HOTAIR)在卵巢癌中表達上調(diào)，敲除HOTAIR基因可抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬，從而提高卵巢癌對順鉑的敏感性[6]。有研究[7]通過基因芯片篩選卵巢癌中差異表達的lncRNA發(fā)現(xiàn)，蛋白酪氨酸磷酸酶受體G基因反義鏈1(PTPRG-AS1)在卵巢癌細胞中表達上調(diào)。PTPRG-AS1是PTPRG的反義lncRNA，PTPRG可通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制鼻咽癌的生長和侵襲[8]。本研究旨在探討PTPRG-AS1調(diào)控PI3K/AKT信號通路對卵巢癌細胞的增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑人正常卵巢上皮細胞HOSE，卵巢癌細胞株SKOV3、A2780、OVCR3購于中科院上海細胞庫；si-con、si-PTPRG-AS1以及PCR引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；PrimeScript one step RT-PCR試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒購于大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、MTT試劑盒、PVDF膜、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640和opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；兔源Cyclin D1、Bcl-2和Bax抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品；鼠源Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K抗體為美國Santa Cruz產(chǎn)品；Trizol試劑、LipofectamineTM2000、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗為Invitrogen公司產(chǎn)品；胰島素生長因子-1(IGF-1)為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2組織來源選擇2016年5月至2017年8月于我院確診并進行手術(shù)切除的41例卵巢癌患者的癌組織和配對癌旁正常卵巢組織。將卵巢癌和正常卵巢組織標(biāo)本分成小塊，用不含RNA酶的磷酸鹽緩沖液洗滌后置于液氮中保存。患者均簽訂知情同意書，術(shù)前均未接受過化療或放療。本研究經(jīng)我院倫理機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)。

1.3細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HOSE、SKOV3、A2780和OVCR3細胞，培養(yǎng)液中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和100 U/mL鏈霉素/青霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度。細胞轉(zhuǎn)染：將對數(shù)期SKOV3接種于6孔板，待細胞約50%～60%匯合時，采用無血清培養(yǎng)基同步化12 h。取適量si-con或si-PTPRG-AS1加入Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫孵育5 min，同時加入LipofectamineTM2000。然后將含有si-con或si-PTPRG-AS1的混合物分別加入SKOV3細胞中，依次標(biāo)記為si-con組、si-PTPRG-AS1組，6 h后，更換含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，檢測轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染si-PTPRG-AS1 48 h后，用PI3K/AKT信號通路激活劑IGF-1處理細胞12 h，標(biāo)記為si-PTPRG-AS1+IGF-1組。

1.4qRT-PCR檢測細胞中PTPRG-AS1mRNA的表達分別提取HOSE、SKOV3、A2780和OVCR3細胞總RNA，利用Prime Script one step RT-PCR試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，采用SYBR Green PCR試劑盒利用Bio-Rad系統(tǒng)進行PCR擴增。引物序列：PTPRG-AS1上游為5’-GGGTAAGCGATC TACGCCC-3’，下游為5’-GTGGTTGCCCTCCTTAG GTC-3’；β-actin上游為5’-AAAGACCTGTACGC CAACAC-3’，下游為5’-GTCATACTCCTGCTTGCT GAT-3’。20 μL反應(yīng)體系: 10 μL 2×SYBR Green Taq 6 μL的H2O，上、下游引物 各1 μL、2 μL cDNA。反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。2-ΔΔCt法計算mRNA表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.5MTT法檢測細胞增殖情況將各轉(zhuǎn)染組SKOV3細胞按照1×103個/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，貼壁后加入20 μL MTT，再培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加150 μL的DMSO，繼續(xù)孵育2 h至結(jié)晶溶解，利用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次。

1.6細胞凋亡檢測將SKOV3細胞按照1×106個/孔接種于6孔板，按照1.3方法進行轉(zhuǎn)染，48 h后，用胰蛋白酶消化細胞，用預(yù)冷的PBS液洗滌細胞2次，2 000 r/min離心5 min。收集細胞，用1×結(jié)合緩沖液重懸，取100 μL細胞懸液(約含1×105個細胞)，隨后分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI，混勻避光孵育10 min，補足至500 μL，混勻后上流式細胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.7Western blot檢測Cyclin D1、PTPRG、PI3K、Bcl-2、p-Akt、p-PI3K蛋白RIPA裂解液提取細胞總蛋白。取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h，4 ℃條件下與一抗(Cyclin D1、PTPRG、PI3K按照1∶1 000稀釋，Bax、Akt按照1∶1 500稀釋，Bcl-2按照1∶2 000稀釋，p-Akt按照1∶800稀釋，p-PI3K按照1∶500稀釋)孵育過夜，PBS沖洗3次，加二抗室溫孵育2 h。利用ECL發(fā)光顯色，Image J分析各條帶灰度值，β-actin為內(nèi)參。以目的蛋白和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0分析，2種卵巢組織中PTPRG-AS1 mRNA表達的比較采用配對t檢驗，si-con和si-PTPRG-AS1組、si-PTPRG-AS1和si-PTPRG-AS1+IGF-1組SKOV3細胞各指標(biāo)的比較采用兩獨立樣本t檢驗；4種卵巢細胞間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.12種卵巢組織中PTPRG-AS1mRNA的表達卵巢癌組織中PTPRG-AS1表達量(3.21±0.22)較配對癌旁正常卵巢組織(1.00±0.09)增加(t=62.056，P<0.001)。

2.24種卵巢細胞中PTPRG-AS1mRNA的表達卵巢癌細胞株(SKOV3、A2780、OVCR3)中PTPRG-AS1表達水平較正常卵巢上皮細胞HOSE升高(P<0.05)，見表1。

表1 4種卵巢細胞中PTPRG-AS1 mRNA的表達

2.32組SKOV3細胞增殖和凋亡比較si-PTPRG-AS1組SKOV3細胞PTPRG-AS1的表達水平較si-con組降低，提示抑制PTPRG-AS1表達的卵巢癌細胞株構(gòu)建成功。與si-con組比較，si-PTPRG-AS1組SKOV3細胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達、細胞活力降低，Bax蛋白表達、細胞凋亡率升高，見圖1和表2、3。

圖1 2組SKOV3細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達

表2 2組SKOV3細胞PTPRG-AS1 mRNA、增殖和凋亡的比較(n=3)

表3 抑制PTPRG-AS1的表達對SKOV3細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的比較(n=3)

2.42組SKOV3細胞PTPRG及PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達與si-con組比較，si-PTPRG-AS1組SKOV3細胞PTPRG蛋白表達升高，p-Akt、p-PI3K蛋白表達降低，見圖2和表4，提示抑制PTPRG-AS1表達可上調(diào)SKOV3細胞PTPRG蛋白的表達，抑制PI3K/Akt信號通路活化。

2.5激活PI3K/Akt信號通路對SKOV3細胞增殖和凋亡的影響與si-PTPRG-AS1組比較，si-PTPRG-AS1+IGF-1組SKOV3細胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達、細胞A值升高，Bax蛋白表達、細胞凋亡率降低，見圖3和表5、6。以上結(jié)果表明，激活PI3K/Akt信號通路能夠逆轉(zhuǎn)抑制PTPRG-AS1表達對SKOV3細胞增殖和凋亡的影響。

圖2 2組SKOV3細胞PTPRG及PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達

表4 2組SKOV3細胞PTPRG及PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達( n=3)

圖3 激活PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)PTPRG-AS1 siRNA對SKOV3細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

表5 激活PI3K/Akt信號通路對SKOV3細胞增殖和凋亡的影響(n=3)

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，每年全球有20多萬婦女被診斷出卵巢癌[9]。因此，了解卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的有效治療方法對卵巢癌患者的精準(zhǔn)治療意義重大。

lncRNA在轉(zhuǎn)錄和翻譯中起著重要的作用。PTPRG-AS1是近年來發(fā)現(xiàn)的新型lncRNA，PTPRG-AS1在乳腺癌組織中表達上調(diào)，與患者的預(yù)后和治療有關(guān)[10]；在膠質(zhì)瘤細胞中，PTPRG-AS1通過靶向miR-185-5p調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的生長[11]；在鼻咽癌中，PTPRG-AS1通過miR-194-3p分子海綿作用上調(diào)細胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1(PRC1)表達進而調(diào)控鼻咽癌細胞的放射敏感性和轉(zhuǎn)移[12]。然而，PTPRG-AS1在卵巢癌中的作用并未完全闡明。本研究結(jié)果顯示，與正常卵巢上皮細胞比較，3株卵巢癌細胞中PTPRG-AS1 mRNA的表達升高，與前人研究[7]相吻合。本研究結(jié)果亦表明抑制PTPRG-AS1表達后，SKOV3細胞增殖降低，細胞凋亡率增加促增殖蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高，提示PTPRG-AS1可作為卵巢癌治療的新型分子靶點。

PI3K/Akt途徑是許多信號分子下游信號傳導(dǎo)通路，其激活參與調(diào)控細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移和凋亡，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，大量研究表明，PI3K/Akt信號通路在卵巢癌中表現(xiàn)活躍，進而導(dǎo)致癌細胞的增殖和凋亡異常。Jin等[13]發(fā)現(xiàn)，lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)通過激活PI3K/AKT通路促進上皮性卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移；王莉等[14]發(fā)現(xiàn)，利用siRNA干擾技術(shù)沉默高爾基體磷蛋白3(GOLPH3)可抑制PI3K/Akt信號通路進而抑制卵巢癌細胞的增殖，促進其凋亡。阻斷PI3K/Akt信號通路是遏制卵巢癌進展的關(guān)鍵策略[15]。反義鏈RNA是研究最廣泛的一類lncRNA，其通過與正義鏈的mRNA相互作用調(diào)控基因沉默、轉(zhuǎn)錄及mRNA的穩(wěn)定性[16-17]。有研究[8]顯示，PTPRG通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路參與對鼻咽癌細胞生長和侵襲的調(diào)控。PTPRG-AS1是PTPRG的反義鏈lncRNA，卵巢癌細胞系中PI3K/Akt通路異常[15]。本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制PTPRG-AS1在SKOV3細胞表達后，p-Akt的表達水平下降，而PTPRG蛋白的表達升高；進一步研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/AKT信號通路可逆轉(zhuǎn)抑制PTPRG-AS1表達對卵巢癌細胞的增殖和凋亡的影響。以上結(jié)果提示抑制PTPRG-AS1表達通過抑制PI3K/AKT途徑活化進而降低卵巢癌細胞增殖能力，促進細胞凋亡，其機制可能與調(diào)控PTPRG表達有關(guān)。但其具體調(diào)控機制還有待進一步深入研究。

綜上所述，lncRNA PTPRG-AS1在卵巢癌中表達上調(diào)，抑制lncRNA PTPRG-AS1表達可通過抑制PI3K/AKT途徑降低卵巢癌細胞增殖能力，并促進細胞凋亡。PTPRG-AS1有望成為一種新的卵巢癌治療分子靶點。