王浩，陳群超，殷麗麗

蘇州市立醫(yī)院 蘇州市區(qū)域性骨質(zhì)疏松指導(dǎo)中心，江蘇蘇州215000

在骨關(guān)節(jié)炎（OA）發(fā)展過程中，軟骨細(xì)胞中受損的細(xì)胞器和降解的大分子物質(zhì)逐漸積累，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞合成、分解代謝失衡，軟骨細(xì)胞功能異常、生存能力下降，細(xì)胞外基質(zhì)合成能力下降，從而加速了軟骨細(xì)胞退變［1-2］。自噬是一種細(xì)胞自我降解并回收細(xì)胞內(nèi)組分的過程，在維持細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)和提高細(xì)胞存活率方面具有重要作用［3］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬中，與ULK1、Beclin1 和LC3 自噬相關(guān)的基因分別發(fā)揮誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)、執(zhí)行的作用［4］。哺乳動(dòng)物中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可負(fù)調(diào)節(jié)自噬過程，在軟骨細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［5］。雷帕霉素可以抑制mTOR 信號(hào)通路的mTOR 復(fù)合物1（mTORC1）表達(dá)［6］，其是否可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的自噬水平鮮見報(bào)道。2018 年 5 月—2020 年 5 月，本研究比較了中晚期OA 患者軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)因子的表達(dá)變化，并觀察雷帕霉素對(duì)中晚期OA 患者軟骨細(xì)胞自噬的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 藥物：雷帕霉素購自北京索萊寶科技有限公司。主要試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶溶液、Ⅱ型膠原酶均購自美國 Hycolon 公司，TRIzol 試劑、Taq PCR 反應(yīng)試劑盒均購自中國大連寶生物公司，dNTP Promega、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自加拿大Fermentas 公司；抗ULK1、抗Beclin1、抗LC3均購自英國Abcam公司。引物：自噬相關(guān)基因 ULK1、Beclin1、LC3 及內(nèi)參 β-actin 引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 標(biāo)本獲取及分組 根據(jù)Kellgren and Lawrence影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇我院截肢手術(shù)或膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中獲得的膝關(guān)節(jié)正常軟骨標(biāo)本5 例份（正常對(duì)照組）、中期OA 軟骨標(biāo)本10 例份（中期OA 組）、晚期OA 軟骨標(biāo)本10 例份（晚期OA 組）。排除既往有膝關(guān)節(jié)感染性疾病和明顯關(guān)節(jié)外傷患者、多類型關(guān)節(jié)炎（繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）患者的膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本。本研究通過南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者均簽署知情同意書。

1.3 軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取各組軟骨標(biāo)本，生理鹽水反復(fù)沖洗，轉(zhuǎn)移至盛有DMEM 培養(yǎng)基的離心管中，在低溫條件下盡快轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離。在無菌的50 mL 離心管中放入適量軟骨組織，加入少量培養(yǎng)基直至樣品浸沒；將小于1 mm3的小塊軟骨用無菌生理鹽水清洗并干燥，加入0.25%胰蛋白酶消化并離心（1 000 r/min，離心半徑6 cm，離心3 min），加入0.2%膠原酶溶液，37 ℃水浴中搖動(dòng)并消化；使用無菌200 目不銹鋼無菌濾網(wǎng)過濾并離心（1 000 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min），用無菌生理鹽水懸浮沉淀細(xì)胞，并重復(fù)離心1次（1 000 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min）。將沉淀細(xì)胞懸浮于20% FBS 培養(yǎng)基中，以（0.5～2）×105/mL 接種在燒杯或培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，按時(shí)更換培養(yǎng)液。

1.4 軟骨細(xì)胞 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取各組軟骨細(xì)胞，采用TRIzol 法提取總RNA，通過核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測總RNA 純度以及RNA 片段的完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR 試劑盒進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)體系30μL：10×buffer（Mg2+free）3 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP（25 mmol/L）0.36 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，探針0.6 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 18.74 μL，cDNA 2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 2 min，95 ℃變性 20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共循環(huán) 30 次。以 β-actin 為內(nèi)參，采用 2－ΔΔCt法計(jì)算各組ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，其引物序列、擴(kuò)增長度見表1。

表1 ULK1、Beclin1、LC3及β-actin的引物序列及擴(kuò)增長度

1.5 軟骨細(xì)胞ULK1、Beclin1、LC3 蛋白表達(dá)檢測采用Western blotting法。取各組軟骨細(xì)胞，使用預(yù)冷的蛋白提取液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移后迅速去膜，并在TBST溶液中洗滌3 min，封閉1 h；加入 ULK1、Beclin1、LC3 一抗（稀釋比例均為1∶500），室溫條件下孵育2 h，TBST洗滌；加入二抗（稀釋比例均為1∶500），室溫條件下孵育2 h，TBST洗滌。ECL顯色劑曝光、顯影，采用Quantity One凝膠圖像分析軟件測定目標(biāo)蛋白條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 雷帕霉素對(duì)各組軟骨細(xì)胞ULK1、Beclin1、LC3表達(dá)影響的觀察

1.6.1 雷帕霉素處理 取各組傳至2 代的軟骨細(xì)胞，以1×105/孔接種到6 孔板中，孔板中添加適量低糖DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)30%～40%時(shí)，分別向細(xì)胞中加入等體積無血清培養(yǎng)基（記做0 μmol/L 雷帕霉素）及1、5、10μmol/L雷帕霉素。

1.6.2 雷帕霉素處理后軟骨細(xì)胞ULK1、Beclin1、LC3表達(dá)檢測 各組細(xì)胞經(jīng)雷帕霉素處理后，將孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；6 h后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入2 mL含10%FBS的新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。參照1.4 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測細(xì)胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)，參照1.5采用Western blotting法檢測細(xì)胞ULK1、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組細(xì)胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與中期OA組比較，#P＜0.05。

組別正常對(duì)照組中期OA組晚期OA組ULK1 mRNA 0.001 3±0.000 4 0.000 6±0.000 2*0.000 2±0.000 1*#蛋白0.297 0±0.018 3 0.093 3±0.005 0*0.029 0±0.001 0*#Beclin1 mRNA 0.019 6±0.007 1 0.008 4±0.001 9*0.002 6±0.000 9*#蛋白0.947 0±0.007 0 0.853 7±0.011 7*0.376 3±0.003 5*#LC3 mRNA 0.003 7±0.001 0 0.001 3±0.000 3*0.000 7±0.000 2*#蛋白0.574 7±0.002 3 0.324 0±0.007 9*0.068 7±0.002 5*#

2.2 各組細(xì)胞經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后ULK1、 Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組細(xì)胞經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與同組加入0μmol/L雷帕霉素比較，*P＜0.05；與正常對(duì)照組加入同濃度雷帕霉素比較，#P＜0.05；與中期OA組加入同濃度雷帕霉素比較，△P＜0.05。

組別正常對(duì)照組0μmol/L雷帕霉素1μmol/L雷帕霉素5μmol/L雷帕霉素10μmol/L雷帕霉素中期OA組0μmol/L雷帕霉素1μmol/L雷帕霉素5μmol/L雷帕霉素10μmol/L雷帕霉素晚期OA組0μmol/L雷帕霉素1μmol/L雷帕霉素5μmol/L雷帕霉素10μmol/L雷帕霉素ULK1 mRNA 0.001 3±0.000 4 0.001 8±0.000 5 0.002 9±0.000 6*0.003 2±0.000 6*0.000 6±0.000 2#0.001 1±0.000 3#0.002 1±0.001 1*0.002 9±0.000 9*0.000 2±0.000 1#△0.000 3±0.000 1#△0.000 4±0.000 2#△0.000 8±0.000 3*#△蛋白0.361 0±0.002 6 0.545 0±0.031 7*0.804 3±0.036 2*0.899 0±0.041 6*0.279 3±0.015 3#0.597 3±0.009 6*0.647 7±0.030 9*#1.028 0±0.035 9*#0.050 0±0.004 4#△0.075 0±0.006 1#△0.132 7 ± 0.022 7*#△0.201 0 ± 0.032 7*#△Beclin1 mRNA 0.019 6±0.007 1 0.024 1±0.006 1 0.039 9±0.006 7*0.042 9±0.011 5*0.008 0±0.001 6#0.012 6±0.002 4#0.020 7±0.006 9*#0.026 7±0.005 0*#0.002 7±0.000 7#△0.003 2±0.000 8#△0.003 9±0.001 4#△0.005 4±0.000 8*#△蛋白0.537 3±0.031 0 0.779 3±0.063 7*0.945 3±0.058 9*0.999 3±0.043 5*0.463 7±0.014 2#0.887 3±0.014 4*#0.932 0±0.023 0*1.016 7±0.038 0*0.190 0±0.004 4#△0.230 7±0.008 4#△0.290 0±0.021 5#△0.484 7±0.105 1*#△LC3 mRNA 0.003 7±0.001 0 0.004 8±0.000 8 0.007 7±0.001 9*0.008 4±0.001 0*0.001 3±0.000 3#0.002 2±0.000 5#0.003 9±0.000 9*#0.005 4±0.001 4*#0.000 7±0.000 2#△0.000 9±0.000 3#△0.001 3±0.000 4#△0.002 2± 0.001 0*#△蛋白0.625 3±0.025 6 0.750 7±0.032 5*0.954 0±0.047 7*1.061 3±0.040 6*0.372 3±0.023 0#0.730 3±0.046 6*0.931 7±0.008 4*1.110 7±0.178 0*0.164 7±0.023 1#△0.202 7±0.014 2#△0.225 0±0.020 8#△0.538 0 ± 0.065 2*#△

3 討論

OA 是一種退行性疾病，會(huì)影響包括軟骨、軟骨下骨和滑膜在內(nèi)的整個(gè)關(guān)節(jié)，最終使關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性改變［7］。關(guān)節(jié)軟骨由少量的軟骨細(xì)胞和豐富的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，軟骨細(xì)胞的正常功能狀態(tài)在維持代謝穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性中具有重要作用［8］。因此，軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育形成、退變中扮演重要角色。自噬可以不斷降解自身細(xì)胞器和受損的大分子物質(zhì)，因此是細(xì)胞自我保護(hù)的機(jī)制之一。自噬在軟骨細(xì)胞的成熟和穩(wěn)態(tài)中也具有重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中期OA 組、晚期OA 組細(xì)胞 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照組，且晚期OA 組降低更明顯；說明隨著OA 的進(jìn)展，軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達(dá)逐漸降低；提示自噬是軟骨細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，當(dāng)軟骨細(xì)胞受損后，自噬水平被抑制，進(jìn)一步加速了OA 的進(jìn)程。這與CAR?AMéS等［9］、LOTZ等［10］的研究結(jié)果一致。

雷帕霉素是臨床上常用的自噬誘導(dǎo)劑。CAR?AMéS 等［9］使用雷帕霉素體外處理軟骨機(jī)械損傷模型，發(fā)現(xiàn)其自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)顯著增加，軟骨細(xì)胞凋亡和蛋白聚糖損失顯著減少。雷帕霉素可能通過調(diào)節(jié)mTOR 信號(hào)通路，參與細(xì)胞自噬和減慢軟骨細(xì)胞變性。但OA 是由體內(nèi)和體外多種因素引起的，僅基于實(shí)驗(yàn)室獲得的軟骨模型可能無法真正替代人類的OA 軟骨。因此，本研究使用雷帕霉素干預(yù)人OA 軟骨細(xì)胞。由于早期OA 軟骨標(biāo)本獲取困難，本研究僅觀察了中晚期OA 軟骨細(xì)胞的自噬水平。結(jié)果顯示，與同組加入0μmol/L 雷帕霉素處理后比較，正常對(duì)照組、中期 OA 組經(jīng) 5、10 μmol/L 雷帕霉素處理后 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達(dá)均升高，晚期OA 組經(jīng)10μmol/L 雷帕霉素處理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達(dá)均升高；說明雷帕霉素可促進(jìn)正常軟骨細(xì)胞及中晚期OA 患者軟骨細(xì)胞的自噬過程。本研究結(jié)果顯示，與經(jīng)相同濃度雷帕霉素處理后的中期OA 組比較，晚期OA 組ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達(dá)均降低；說明雷帕霉素在中期OA 軟骨細(xì)胞中具有更強(qiáng)的自噬誘導(dǎo)作用，而對(duì)于晚期OA 軟骨細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用明顯減弱。分析原因，OA 軟骨細(xì)胞自噬受到抑制，可預(yù)防性地發(fā)生細(xì)胞凋亡，晚期OA 軟骨細(xì)胞降解、功能異常、自噬過程受阻更明顯，因此雷帕霉素調(diào)節(jié)晚期OA軟骨細(xì)胞自噬的作用受到限制［11-12］。

CHANG 等［13］研究顯示，在正常氧含量條件下，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可上調(diào)正常軟骨細(xì)胞自噬，降低細(xì)胞凋亡率；而在低氧條件下，自噬抑制劑3-MA可下調(diào)OA 軟骨細(xì)胞自噬，降低細(xì)胞凋亡率；提示上調(diào)正常軟骨細(xì)胞自噬水平能促進(jìn)軟骨細(xì)胞生存，而上調(diào)OA 軟骨細(xì)胞自噬則促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。而CARAMéS 等［9］及 SASAKI 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可上調(diào)OA 軟骨細(xì)胞自噬，降低細(xì)胞凋亡率。這些結(jié)果之間的差異表明，某些外部因素能夠調(diào)節(jié)自噬對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。IGLEWSKI 等［14］研究表明，自噬對(duì)細(xì)胞存活的影響取決于細(xì)胞外刺激的類型。當(dāng)細(xì)胞暴露于DNA 損傷劑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和放射性環(huán)境中時(shí)，自噬活性增強(qiáng)有助于細(xì)胞存活；而當(dāng)細(xì)胞處于低氧、砒霜作用等環(huán)境中時(shí)，自噬活動(dòng)增強(qiáng)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，雷帕霉素調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬從而影響細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。