李 揚(yáng) 牧亞峰 左新河, 田 曼▲ 趙 勇

1.湖北省中醫(yī)院甲狀腺疾病診療中心，湖北武漢 430070；2.湖北省中醫(yī)藥研究院甲狀腺疾病診療中心，湖北武漢 430070；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北武漢 430061

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是一種甲狀腺的自身免疫性疾病，臨床中以橋本甲狀腺炎（hashimoto thyroiditis，HT）最為常見，近年來HT的發(fā)病率高達(dá)3%～4%，并呈逐年增高趨勢[1-2]。AIT 的典型病理改變?yōu)榧谞钕倭馨图?xì)胞浸潤，進(jìn)一步出現(xiàn)纖維化、腫大或結(jié)節(jié)樣改變，甚至引起甲狀腺功能減退，并對妊娠結(jié)局有不良影響，研究其防治對優(yōu)生優(yōu)育有重要意義。本病目前尚無根治方法，西醫(yī)主要以對癥治療為主，或聯(lián)合硒劑或糖皮質(zhì)激素等藥物，而激素類藥物易并發(fā)胃腸道反應(yīng)、糖代謝異常及電解質(zhì)紊亂等諸多不良反應(yīng)，因此尋求安全有效的治療策略十分必要。中醫(yī)藥在治療AIT 方面有獨(dú)特的優(yōu)勢，益氣養(yǎng)陰消癭方是已故全國名中醫(yī)陳如泉教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)所擬，具益氣養(yǎng)陰、消癭散結(jié)之功，臨床療效良好，且不良反應(yīng)少，前期研究發(fā)現(xiàn)該方能改善AIT 模型大鼠甲狀腺功能、減輕甲狀腺腫大[3]。本研究擬進(jìn)一步探討其對AIT 的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，為該方臨床應(yīng)用提供更深層次理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～5 周SPF 級雌性SD 大鼠50 只，體重100～120 g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（動(dòng)物許可證號(hào)SCXK 鄂2017—0012，合格證號(hào)：42010200002809），由湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫20～24℃，濕度40%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 主要藥物與試劑

豬甲狀腺球蛋白（pTg）、碘化鈉（NaI）、完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA），購自Sigma 公司（貨號(hào)分別為T1126、746371、F5881、F5506）。B 細(xì)胞活化因子（BAFF）檢測試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號(hào)：SEB686Ra）。白細(xì)胞介素-10（IL-10）一抗（IL-10 Rabbit pAb，abclonal 公司，批號(hào)：A2171），Dako REAL EnVision Detection System（安捷倫Dako，K5007）。促甲狀腺激素（TSH）、甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司；批號(hào)分別為E-EL-R0976、SBJ-R0551、CSBE11199r）。益氣養(yǎng)陰消癭方為陳如泉教授所擬，由黃芪30 g、白芍30 g、鬼箭羽20 g、穿山龍20 g 四味中藥配制成1 g/mL 的溶液。

1.3 動(dòng)物分組及造模方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、益氣養(yǎng)陰消癭方低、中、高劑量組，每組10 只。除正常對照組外，其余組大鼠按本課題組前期成熟方法進(jìn)行造模[4-6]。初次免疫：pTg 與CFA 等體積混合乳化，多部位皮下免疫注射（pTg 100 μg/只），每周1 次，共2 次，同時(shí)給予高碘水（1 L 水中加入0.64g NaI）直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。再次免疫：pTg 與IFA 等體積混合乳化，再次進(jìn)行多部位皮下免疫注射（pTg 100 μg/只），每周1 次，共4 次。

1.4 給藥方法

造模后開始藥物干預(yù)，正常對照組與模型組每天予以生理鹽水5 mL/kg 灌胃，益氣養(yǎng)陰消癭方低、中、高劑量組分別以益氣養(yǎng)陰消癭方溶液6、12、24 g/kg灌胃，連續(xù)6 周。

1.5 檢測方法：

1.5.1 ELISA 法檢測血清TSH、TGAb、TPOAb 及BAFF含量 心臟采血，室溫靜置2 h，以轉(zhuǎn)速2000 r/min 離心10 min，離心半徑6 cm，取血清至EP 管中，-20℃儲(chǔ)存。血清TSH、TGAb、TPOAb 及BAFF 檢測均按試劑盒說明書詳細(xì)步驟規(guī)范操作，讀數(shù)。

1.5.2 免疫組化法檢測甲狀腺組織IL-10 的相對表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠禁食禁水12 h，稱重，10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離甲狀腺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色觀察甲狀腺組織病理改變，免疫組化法檢測甲狀腺組織IL-10 表達(dá)。主要步驟為：脫蠟，3%過氧化氫液封閉，血清封閉，再分別加入IL-10 的一抗（1∶100），孵育，PBS 沖洗，再按Dako REAL EnVision Detection System試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，最后經(jīng)DAB 溶液顯色。陰性對照以PBS 代替一抗。以棕黃色顆粒為陽性。每張玻片隨機(jī)選擇20 個(gè)視野（400×），用HMIAS-2000 千屏高清彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度測量并自動(dòng)轉(zhuǎn)換為吸光度（A）值，每個(gè)標(biāo)本的IL-10 相對表達(dá)含量用20 個(gè)視野的平均A 值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比較

與正常對照組比較，模型組血清TSH、TGAb、TPOAb 濃度均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。益氣養(yǎng)陰消癭方中、高劑量組TSH、TPOAb、TGAb 濃度均低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01），益氣養(yǎng)陰消癭方低劑量組TPOAb、TGAb 濃度低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。益氣養(yǎng)陰消癭方中、高劑量組TSH 濃度均低于益氣養(yǎng)陰消癭方低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；而益氣養(yǎng)陰消癭方中、高劑量組TSH 濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。益氣養(yǎng)陰消癭方低、中、高劑量組TPOAb 濃度兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。益氣養(yǎng)陰消癭方高劑量組TGAb 濃度低于益氣養(yǎng)陰消癭方中、低劑量組，且益氣養(yǎng)陰消癭方中劑量組低于益氣養(yǎng)陰消癭方低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比較（）

表1 各組大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比較（）

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與益氣養(yǎng)陰消癭方低劑量組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與益氣養(yǎng)陰消癭方中劑量組比較，▲P ＜0.05。TSH：促甲狀腺激素；TPOAb：甲狀腺過氧化物酶抗體；TGAb：甲狀腺球蛋白抗體

2.2 各組大鼠甲狀腺組織病理觀察結(jié)果

與正常對照組比較，模型組甲狀腺組織可見大量淋巴細(xì)胞浸潤，甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)紊亂。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰消癭方各劑量組甲狀腺淋巴細(xì)胞浸潤減少，甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)紊亂減輕。見圖1。

2.3 各組大鼠血清BAFF 含量比較

與正常對照組比較，模型組血清BAFF 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰消癭方各劑量組BAFF 含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。益氣養(yǎng)陰消癭方高劑量組BAFF 含量低于益氣養(yǎng)陰消癭方低劑、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），益氣養(yǎng)陰消癭方低、中劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖2。

2.4 各組大鼠甲狀腺組織IL-10 的表達(dá)水平比較

在大鼠甲狀腺組織中，IL-10 主要表達(dá)于濾泡上皮細(xì)胞。與正常對照組比較，模型組甲狀腺組織IL-10相對表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰消癭方各劑量組甲狀腺組織IL-10 相對表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。益氣養(yǎng)陰消癭方中、高劑量組IL-10表達(dá)水平均高于益氣養(yǎng)陰消癭方低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。益氣養(yǎng)陰消癭方中、高劑量組IL-10 相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖3～4。

圖1 各組大鼠甲狀腺組織病理學(xué)觀察（HE 染色，100×）

圖2 各組大鼠血清BAFF 水平比較（n=10）

圖3 各組大鼠甲狀腺組織IL-10 免疫組化（400×）

3 討論

HT 是AIT 中最為常見的類型，TGAb、TPOAb 是參與HT 病理損傷的核心抗體，抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用是HT 的主要病理機(jī)制[7]。目前西藥治療HT 方法十分有限，臨床用藥局限于硒制劑糖皮質(zhì)激素。本研究采用以皮下注射pTg 并配合高碘水喂養(yǎng)的經(jīng)典方法模擬HT 模型，觀察了益氣養(yǎng)陰消癭方對AIT 模型大鼠TGAb、TPOAb 的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰消癭方可顯著降低血清TGAb、TPOAb 含量，下調(diào)TSH 水平，體現(xiàn)出對甲狀腺功能的保護(hù)作用，從而顯示了中藥調(diào)節(jié)甲狀腺免疫失衡的優(yōu)勢。

圖4 各組大鼠甲狀腺組織IL-10 免疫組化吸光度半定量分析（n=10）

多數(shù)研究證實(shí)T 細(xì)胞免疫失調(diào)是AIT 的核心機(jī)制[8-10]，而B 細(xì)胞的激活及其對T 細(xì)胞應(yīng)答的效應(yīng)是AIT 不可或缺的重要環(huán)節(jié)[11-12]。TGAb、TPOAb 均由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，B 細(xì)胞激活CD8+T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[13]，損傷甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞[14]。BAFF 是B 細(xì)胞活化的重要細(xì)胞因子，調(diào)控B 細(xì)胞的活化、增殖及分化[15]，HT患者血清BAFF 水平升高[15-16]。目前針對B 細(xì)胞免疫環(huán)節(jié)治療AIT 的中醫(yī)藥研究相對較少，故本研究探討了益氣養(yǎng)陰消癭方對AIT 模型大鼠BAFF 的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，模型組血清BAFF 水平較正常對照組明顯升高，提示AIT 模型大鼠B 細(xì)胞免疫被激活，而益氣養(yǎng)陰消癭方可顯著降低血清BAFF 水平，從而抑制B 細(xì)胞活化，提示該方可通過下調(diào)BAFF 水平發(fā)揮重要的B 細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用。

IL-10 是一種免疫抑制因子，可以抑制T 淋巴細(xì)胞活化[17]，減少甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤，并一定程度上阻止甲狀腺濾泡細(xì)胞的破壞[18]。1 項(xiàng)對91 例HT患者的臨床數(shù)據(jù)分析顯示其血清IL-10 水平顯著減低，提示HT 患者該細(xì)胞因子功能下降[19]。本研究顯示AIT 模型大鼠甲狀腺組織IL-10 水平顯著降低，該結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[20-21]。Rosser 等[22]研究發(fā)現(xiàn)分泌IL-10 的B 細(xì)胞具有免疫抑制作用，稱其為調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞（Breg 細(xì)胞），Breg 細(xì)胞能改變T 細(xì)胞分化[23]，可通過IL-10 抑制Th1 免疫反應(yīng)，并間接抑制Th1、Th17 細(xì)胞分化[24]，而后者功能紊亂是HT 的重要機(jī)制[25]。本研究探索了益氣養(yǎng)陰消癭方對AIT 模型大鼠甲狀腺組織IL-10 表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)其可顯著增加甲狀腺組織IL-10 的表達(dá)，故而推測該方可能通過促進(jìn)分泌IL-10 的Breg 細(xì)胞的生成而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

AIT 可歸屬于中醫(yī)“癭病”范疇，多因情志內(nèi)傷、肝氣郁結(jié)，而致脾運(yùn)失健，脾氣虛弱，津液無以敷布，凝聚為痰，陰津虧虛，血行不暢，瘀血內(nèi)滯，痰瘀互結(jié)，壅結(jié)頸部而成。臨床上HT 患者多屬氣陰兩虛證，陳如泉教授以“益氣養(yǎng)陰法”為治則，擬益氣養(yǎng)陰消癭方，由黃芪、白芍、鬼箭羽、穿山龍四味藥組成，方中黃芪為君藥，健脾益氣；白芍為臣，柔肝理氣；佐以鬼箭羽、穿山龍活血通經(jīng)、消癭散結(jié)，全方共奏“益氣養(yǎng)陰、消癭散結(jié)”之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可提高免疫抑制小鼠Treg 細(xì)胞數(shù)的比例[26-28]；白芍總苷有利于恢復(fù)Th17/Treg 平衡[29]；穿山龍可調(diào)節(jié)HT 患者外周Th17、Treg 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子[30]。這些研究均佐證了益氣養(yǎng)陰消癭方的免疫調(diào)節(jié)功能。本研究結(jié)果顯示益氣養(yǎng)陰消癭方可降低AIT 大鼠TSH、TGAb、TPOAb 水平，改善免疫失衡狀態(tài)，可能與其抑制B 細(xì)胞活化的機(jī)制相關(guān)，為其臨床應(yīng)用提供了更深層的理論依據(jù)。