鞏嬋嬋，李艷青，展 瑞，湯 穎，陸夏良

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率以每年0.2%～8%的幅度上升，嚴(yán)重威脅女性身心健康[1-2]。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生是導(dǎo)致乳腺癌治療失敗的主要原因之一，因此，研究乳腺癌細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制，對(duì)發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)具有重要意義[3]。PAK5是p21激活激酶(p21-activated kinase, PAK)家族中的成員之一[4]。研究表明，PAK5可通過調(diào)控NF-κB促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，并參與乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移過程[5]。此外，PAK5還參與了肝癌細(xì)胞及食管鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥[6-7]，PAK5表達(dá)可使卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇產(chǎn)生耐藥[8]。因此，PAK5很可能參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥進(jìn)程，而PAK5在乳腺癌細(xì)胞耐藥中的機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證PAK5在乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥中的作用，并探討PAK5對(duì)β-catenin通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細(xì)胞BT-549、MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，L-15培養(yǎng)基、CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自凱基生物公司；無支原體胎牛血清購(gòu)自中國(guó)杭州四季青公司；胰酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗PAK5抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，β-catenin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，PAK5過表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自上海艾博思生物公司。PAK5干擾序列購(gòu)自上海吉瑪基因公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京碧云天公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與耐藥株誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株BT-549、MDA-MB-231分別于含10%胎牛血清的RPMI-1640、L-15培養(yǎng)基中，加入適量青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)，在含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BT-549和MDA-MB-231細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后，離心棄上清，后重懸取約106個(gè)細(xì)胞接種于含阿霉素(ADR，初濃度0.02 μg/mL)、紫杉醇(PTX，初濃度為0.2 μg/mL)的培養(yǎng)基中，待細(xì)胞存活狀態(tài)穩(wěn)定后，不斷提高藥物濃度，直到其IC50值至少達(dá)到親本細(xì)胞IC50值的10倍以上，并能在RPMI-1640(L15)培養(yǎng)液中穩(wěn)定地生長(zhǎng)，持續(xù)傳代。后定期給予一定濃度的阿霉素或紫杉醇，間斷刺激。

1.3 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)胰酶消化對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(耐藥細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)組時(shí)，其對(duì)應(yīng)的親本細(xì)胞株為對(duì)照組；PAK5過表達(dá)組為實(shí)驗(yàn)組時(shí)，其對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組；干擾PAK5組為實(shí)驗(yàn)組，其對(duì)照組為干擾無關(guān)序列組)。向96孔板每孔鋪5×103個(gè)細(xì)胞。一豎排鋪5個(gè)孔，每孔為含10%FBS完全培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞100 μL；將鋪好細(xì)胞的96孔板，分別加藥后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h；將添加CCK-8檢測(cè)液的96孔板再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5、1、2、4 h；在相應(yīng)的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)拿出96孔板置酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定相應(yīng)孔的OD值。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，在6孔板中加入含10%FBS完全培養(yǎng)基3 mL，同時(shí)每行3個(gè)孔為一組，細(xì)胞數(shù)分別為100、300、500，實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞數(shù)與其相對(duì)應(yīng)，分別加藥后，將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期進(jìn)行細(xì)胞換液，觀察10～14天，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，即終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液浸洗后吸出；加入4%多聚甲醛固定15 min，后棄固定液，加適量結(jié)晶紫(或Giemsa)染色10～30 min，空氣干燥；將各孔置于白色背景下拍照，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作出統(tǒng)計(jì)圖。

1.5 Western blot法收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用RIPA裂解液充分裂解。按試劑盒方法提取總蛋白，將各組樣品配平，以配制成同體積同濃度同質(zhì)量的樣品。按SDS聚丙烯酰胺凝膠制備分離樣品，NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，5%脫脂牛奶封閉，孵育一抗(PAK5，稀釋比1 ∶1 000；Actin，稀釋比1 ∶5 000)4 ℃過夜；將NC膜取出，室溫復(fù)溫30 min，Washing buffer洗膜；孵育二抗，室溫條件下2 h，Washing buffer漂洗NC膜，滴加ECL發(fā)光液，顯色。

1.6 細(xì)胞免疫熒光定位對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合度后，接種于鋪有蓋玻片的6孔板內(nèi)，待親本細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)開始轉(zhuǎn)染；耐藥株細(xì)胞不作轉(zhuǎn)染處理，培養(yǎng)24 h后，吸出原有培養(yǎng)基，加入提前預(yù)冷的4%多聚甲醛，室溫條件下固定15～20 min；后加入0.5%TritonX-100，室溫下孵育10 min；5%BSA封閉1 h(勿洗)；孵育一抗(β-catenin，稀釋比1 ∶100，用5%BSA作稀釋液)，4 ℃過夜；次日取出6孔板，于室溫條件下復(fù)溫30 min；孵育二抗(稀釋比1 ∶200，用5%BSA作稀釋液)，注意避光操作；后進(jìn)行核染色；完成后取出蓋玻片，略晾干，封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 羅丹明實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%融合度時(shí)，用含2%羅丹明的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃溫箱中30～50 min，后棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 免疫共沉淀提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白，BCA測(cè)蛋白濃度；分為三個(gè)樣品組：Input(80 μg)、對(duì)照組(1 mg)、實(shí)驗(yàn)組(1 mg)；實(shí)驗(yàn)組加抗PAK5蛋白抗體(5 μg)，對(duì)照組加兔源IgG，4 ℃過夜；Input組存放于-20 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組加proteinA/G珠子(約30 μL)，4 ℃條件下旋轉(zhuǎn)混合2～4 h；將對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組4 ℃離心，去上清，后用Western及IP細(xì)胞裂解液洗3遍(每次1 mL)，2 000 r/min離心1 min；加30 μL的2×Loading buffer，煮沸15 min；4 ℃，12 000g離心15 min，取上清；將所取樣品及Input組進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建乳腺癌耐藥細(xì)胞模型選擇兩種常見的人乳腺癌細(xì)胞株BT-549和MDA-MB-231，阿霉素或紫杉醇小劑量濃度遞增法建株，成功構(gòu)建BT-549耐阿霉素細(xì)胞株(BT-549/ADR)、BT-549耐紫杉醇細(xì)胞株(BT-549/PTX)、MDA-MB-231耐阿霉素細(xì)胞株(MDA-MB-231/ADR)和MDA-MB-231耐紫杉醇細(xì)胞株(MDA-MB-231/PTX)。為進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建的乳腺癌耐藥株細(xì)胞的耐藥能力，將4種耐藥株細(xì)胞分別加藥培養(yǎng)后進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞株在24、48、72、96 h時(shí)細(xì)胞增殖均明顯升高(P<0.001，圖1)。同時(shí)，將4種耐藥株細(xì)胞加藥培養(yǎng)后進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞株相比，耐藥細(xì)胞株能形成大量的細(xì)胞集落，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2)。上述實(shí)驗(yàn)表明，與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。

圖2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌耐藥細(xì)胞株的克隆形成能力：A.BT-549/ADR；B.BT-549/PTX；C.MDA-MB-231/ADR；D.MDA-MB-231/PTX

2.2 PAK5對(duì)乳腺癌細(xì)胞耐藥株的影響Western blot法檢測(cè)耐藥細(xì)胞株中PAK5表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞株中PAK5蛋白表達(dá)增加(P<0.001，圖3)。乳腺癌細(xì)胞株中PAK5過表達(dá)，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PAK5過表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.001，圖4)。乳腺癌細(xì)胞株中分別過表達(dá)PAK5和干擾PAK5，依次加藥后，采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其IC50值，與對(duì)照組相比，PAK5過表達(dá)組的IC50值明顯增加，而PAK5干擾組的IC50值則明顯降低(表1)。在乳腺癌細(xì)胞株中過表達(dá)PAK5后行羅丹明染色，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PAK5過表達(dá)組的熒光強(qiáng)度更弱；對(duì)乳腺癌親本細(xì)胞及其耐藥株進(jìn)行羅丹明染色，結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，耐藥株細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度更弱(圖5)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PAK5可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥，且可能是通過影響其耐藥蛋白的表達(dá)。

表1 乳腺癌細(xì)胞株BT-549和MDA-MB-231不同處理?xiàng)l件下的IC50值

圖3 Western blot法檢測(cè)乳腺癌耐藥細(xì)胞株中PAK5的表達(dá)：1. BT-549;2.BT-549/ADR;3.BT-549/PTX;4.MDA-MB-231;5.MDA-MB-231/ADR;6.MDA-MB-231/PTX; 與乳腺癌親本細(xì)胞株相比，***P<0.001

圖4 PAK5可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖：A.BT-549；B.MDA-MB-231；與對(duì)照組相比，***P<0.001

2.3 PAK5對(duì)β-catenin信號(hào)通路的影響乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)PAK5后行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察β-catenin表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PAK5過表達(dá)組中β-catenin表達(dá)明顯增加，且以細(xì)胞核內(nèi)增加為主(圖6)。同時(shí)，親本細(xì)胞株與耐藥細(xì)胞株的免疫熒光結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞株相比，耐藥細(xì)胞株中β-catenin表達(dá)顯著增加(圖6)。為進(jìn)一步探究PAK5與β-catenin的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PAK5可以與β-catenin相結(jié)合；與親本細(xì)胞株相比，在耐藥細(xì)胞株中的結(jié)合增加(圖7)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PAK5可以與β-catenin結(jié)合，且促進(jìn)其表達(dá)。

3 討論

化療在乳腺癌綜合治療中起著不可替代的作用，但往往會(huì)由于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥，導(dǎo)致化療無效或逐漸轉(zhuǎn)為無效，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存率[9-10]。因此，尋找腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制，可能為乳腺癌臨床的治療提供新的潛在作用靶點(diǎn)。PAK5是PAK家族中的成員之一，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而PAK5在乳腺癌細(xì)胞耐藥中的作用仍有待于進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過阿霉素及紫杉醇小劑量濃度遞增法構(gòu)建4種乳腺癌耐藥株細(xì)胞，與親本細(xì)胞株相比，耐藥細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力增加，這些結(jié)果證實(shí)，構(gòu)建的耐藥細(xì)胞株具有穩(wěn)定的耐藥能力。此外，Western blot實(shí)驗(yàn)表明，PAK5在耐藥細(xì)胞株中表達(dá)增加；CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，PAK5過表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。羅丹明123(Rhodamine 123)是一種可透過細(xì)胞膜的陽(yáng)離子熒光染料，可以作為一種熒光指示劑，在耐藥細(xì)胞株中被作為細(xì)胞內(nèi)底物泵出細(xì)胞外，而使細(xì)胞內(nèi)的熒光減弱。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞株中的耐藥蛋白表達(dá)增多；且PAK5可影響乳腺癌細(xì)胞中耐藥蛋白的表達(dá)。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，Wnt信號(hào)通路激活后可抑制β-catenin的降解及磷酸化，導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)的含量蓄積，啟動(dòng)與癌癥相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)PAK5，β-catenin的表達(dá)也增加，且以細(xì)胞核的增加為主；同時(shí)，與親本細(xì)胞株相比，耐藥細(xì)胞株中β-catenin表達(dá)也是增加的。免疫共沉淀結(jié)果證實(shí)，PAK5與β-catenin結(jié)合，且在耐藥細(xì)胞株中的結(jié)合增加。以上結(jié)果表明，PAK5可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，且可能是通過結(jié)合并促進(jìn)β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性實(shí)現(xiàn)的。

β-catenin是Wnt信號(hào)通路的核心調(diào)控因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)揭示了PAK5通過β-catenin參與乳腺癌細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生，為臨床乳腺癌患者耐藥的治療提供了新的理論依據(jù)。

圖5 羅丹明實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAK5對(duì)乳腺癌細(xì)胞中耐藥蛋白表達(dá)的影響：A、B.細(xì)胞株BT-549和MDA-MB-231中分別過表達(dá)PAK5；C、D.羅丹明實(shí)驗(yàn)觀察乳腺癌細(xì)胞系BT-549、MDA-MB-231及其耐藥株中熒光的強(qiáng)弱

圖6 細(xì)胞免疫熒光染色觀察β-catenin的表達(dá)變化：A、B.細(xì)胞株BT-549和MDA-MB-231中β-catenin的表達(dá)；C、D.乳腺癌細(xì)胞系BT-549和MDA-MB-231及其耐藥株中β-catenin的表達(dá)

圖7 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAK5與β-catenin的關(guān)系：A.在乳腺癌細(xì)胞株BT-549中，PAK5可與β-catenin結(jié)合；B.在耐藥株中PAK5與β-catenin結(jié)合增加