呂蓓蓓，劉海亭，陳 旭，王亞文，宋 琳，高 鵬

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，最新研究數(shù)據(jù)顯示其病死率位居第3位[1]。由于其癥狀隱匿，難以早期發(fā)現(xiàn)，胃癌患者確診時(shí)多已為中晚期，5年生存率不足20%，嚴(yán)重危害國(guó)民的身體健康。浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因。目前關(guān)于胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍不明確。SPIN1又名Spindlin1，是SPIN/SSTY基因家族的主要成員，1997年Oh等[2]首次報(bào)道其為從卵母細(xì)胞向胚胎過(guò)渡過(guò)程中在小鼠中表達(dá)的主要母體轉(zhuǎn)錄物，在配子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。此外其還是一種Tudor結(jié)構(gòu)域蛋白，能夠識(shí)別組蛋白H3第四位賴氨酸甲基化(H3K4me3)，通過(guò)與其結(jié)合從而影響表觀遺傳調(diào)控[3-4]。近年研究表明，SPIN1在多種人類惡性腫瘤如卵巢癌、肺癌、肝癌及乳腺癌中高表達(dá)[5-7]，提示SPIN1可能是一個(gè)重要的癌基因，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但迄今為止，SPIN1在胃癌中的表達(dá)水平、生物學(xué)功能和調(diào)控的分子機(jī)制仍不清楚，本文從細(xì)胞水平探究SPIN1對(duì)胃癌遷移、浸潤(rùn)的作用，并初步探究其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑本實(shí)驗(yàn)所用胃癌細(xì)胞株MKN45、BGC823、SGC7901、AGS及HGC27細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)上海腫瘤研究所。細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640)購(gòu)自Invitrogen公司，胎牛血清FBS購(gòu)自Gibco公司，胰蛋白酶、雙抗、PBS干粉、DMSO購(gòu)自索萊寶公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Turbofect購(gòu)自Thermo公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent購(gòu)自Roche公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，引物購(gòu)自濟(jì)南博尚公司，SPIN1抗體購(gòu)自Proteintech公司(19531-1-AP)，vimentin、Zeb1、Zo-1、β-catenin、Snail、Slug、Claudin-1和β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 常規(guī)用RPMI-1640(Hyclone公司，USA)和10%胎牛血清(Gibco公司，USA)在37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。本課題組前期已構(gòu)建SPIN1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒[7]，通過(guò)銳博公司人工合成靶向SPIN1的干擾序列(si-SPIN1)。然后將SPIN1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和si-SPIN1及相應(yīng)的對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株BGC823，使SPIN1表達(dá)上調(diào)/下調(diào)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)選用Turbofect轉(zhuǎn)染試劑，siRNA及對(duì)照轉(zhuǎn)染選用X-tremeGENE轉(zhuǎn)染試劑。

1.2.2RNA提取和qRT-PCR檢測(cè) (1)培養(yǎng)箱取出細(xì)胞后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，根據(jù)貼壁細(xì)胞的數(shù)量酌情加入適量的Trizol裂解細(xì)胞；根據(jù)試劑盒說(shuō)明書的步驟提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，后續(xù)進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。(2)使用Roche Universal SYBR Green Master進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，10 μL反應(yīng)體系：SYBR Green(2×)5 μL，F(xiàn) primer(30 μm)0.1 μL，R primer(30 μm)0.1 μL，cDNA 1 μg，Nuclease-Free Water補(bǔ)足10 μL。(3)反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。(4)結(jié)果分析：選用GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)樣本的Ct值為2個(gè)復(fù)孔的Ct平均值，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)，以相對(duì)表達(dá)量=2-△Ct計(jì)算。

1.2.3Western blot法 分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞沉渣，然后加入混合好的RIPA裂解混合液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，搖床孵育30 min(置于冰上)。孵育結(jié)束后4 ℃離心25 min(12 000 r/min)。收集上清液于新的EP管中。檢測(cè)總蛋白濃度，然后將每個(gè)樣品及蛋白marker上樣至10%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳2 h之后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，采用5%封閉液(40 mL TBST+2 g奶粉)封閉2 h，洗膜后將膜放于一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，再次洗膜后放于二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，最后滴加顯影液顯影、拍照。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn) (1)遷移實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)箱取出轉(zhuǎn)染24 h后的胃癌細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取5×104個(gè)細(xì)胞用200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮后加入普通Transwell小室內(nèi)，沿小室外孔加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，孵箱內(nèi)孵育24 h后觀察結(jié)果。(2)浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)：Transwell小室內(nèi)提前均勻加入稀釋好的基質(zhì)膠(培養(yǎng)基 ∶基質(zhì)膠=4 ∶1)，凝固后即可使用。其余步驟與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的操作步驟相同，細(xì)胞數(shù)增加至8×104個(gè)。(3)24 h后，將小室內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，用棉簽小心擦凈小室內(nèi)膜面未穿出的細(xì)胞。將小室置于800 μL 4%多聚甲醛中，固定穿出外膜的細(xì)胞20 min，然后用結(jié)晶紫溶液染色15 min，小心用雙蒸水沖洗、棉簽擦凈，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。(4)分析結(jié)果：在倒置顯微鏡下，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組隨機(jī)選取3個(gè)視野分別計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad Prism 5及SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用t檢驗(yàn)分析兩組間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5種胃癌細(xì)胞系中SPIN1的表達(dá)量通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)5種胃癌細(xì)胞系中SPIN1的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞系中，SPIN1在轉(zhuǎn)移性胃癌細(xì)胞系SGC7901中的表達(dá)量最高，在HGC27的表達(dá)量最低(圖1A)。

2.2 轉(zhuǎn)染SPIN1質(zhì)粒及si-SPIN1后BGC823中SPIN1的表達(dá)量在胃癌細(xì)胞系BGC823中轉(zhuǎn)染SPIN1質(zhì)粒后，與轉(zhuǎn)染PCDNA 3.1的對(duì)照組相比，SPIN1的表達(dá)量明顯升高(圖1B)，轉(zhuǎn)染si-SPIN1后，與對(duì)照組相比，SPIN1的表達(dá)量明顯降低(圖1C)。

圖1 SPIN1在5種胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)及BGC823細(xì)胞中過(guò)表達(dá)及干擾效率驗(yàn)證：A.各胃癌細(xì)胞系中SPIN1的表達(dá)；B.轉(zhuǎn)染SPIN1后BGC823細(xì)胞中SPIN1的表達(dá)變化，***P<0.001；C.轉(zhuǎn)染si-SPIN1后BGC823細(xì)胞中SPIN1的表達(dá)變化，**P<0.01

2.3 SPIN1表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞BGC823遷移及浸潤(rùn)能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)SPIN1后，BGC823細(xì)胞穿透Transwell小室底濾膜的細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組明顯增多(P<0.05)，提示遷移、浸潤(rùn)能力增強(qiáng)。而相比于對(duì)照組，si-SPIN1組中BGC823細(xì)胞穿透Transwell小室底濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05，圖2)，提示細(xì)胞遷移及浸潤(rùn)能力降低。

ASPIN1PCDNA3.1遷移浸潤(rùn)Bsi-SPIN1NC遷移浸潤(rùn)

2.4 SPIN1對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的調(diào)控作用通過(guò)Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)/沉默SPIN1后BGC823細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白vimentin、Zeb1、Zo-1、β-catenin、Snail、Slug及Claudin-1的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)SPIN1后Slug表達(dá)上調(diào)，Claudin-1表達(dá)下調(diào)；干擾SPIN1后Slug表達(dá)下調(diào)，Claudin-1表達(dá)上調(diào)，其余蛋白未見(jiàn)明顯變化(圖3)。

圖3 過(guò)表達(dá)及干擾SPIN1后對(duì)EMT相關(guān)蛋白Slug及Claudin1表達(dá)的影響：A.過(guò)表達(dá)SPIN1；B.干擾SPIN1

3 討論

胃癌是導(dǎo)致中國(guó)癌癥死亡的主要原因之一，盡管化療是中晚期胃癌患者主要的治療手段，可適當(dāng)延長(zhǎng)患者總生存期，但化療的不良反應(yīng)突出，且易導(dǎo)致耐藥。隨著對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的深入研究，胃癌的分子靶向治療越來(lái)越受到臨床的關(guān)注。目前針對(duì)胃癌的靶點(diǎn)主要包括EGFR、HER-2、VEGF、VEGFR、mTOc-MET、HGF等，除應(yīng)用曲妥珠單抗使得少數(shù)HER-2陽(yáng)性晚期胃癌患者部分獲益外，其他靶向藥物的臨床療效不盡人意。因此，尋找在胃癌發(fā)生、發(fā)展中敏感和特異的基因改變，并研究其發(fā)揮作用的分子機(jī)制，對(duì)胃癌的臨床診治及提供抗癌藥物的新靶點(diǎn)等方面均具有重要的理論和實(shí)際意義。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，SPIN1是個(gè)新穎的癌基因，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5-6,8-9]，但在胃癌中尚未見(jiàn)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)首先在細(xì)胞水平驗(yàn)證了SPIN1在胃癌細(xì)胞系中高表達(dá)，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SGC7901中表達(dá)量最高，結(jié)果提示SPIN1可能與胃癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)是惡性腫瘤的基本特征，胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度是影響患者預(yù)后的重要因素。后續(xù)我們將在臨床樣本水平進(jìn)一步探究SPIN1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。接下來(lái)為了明確SPIN1在胃癌遷移、浸潤(rùn)中的作用，本實(shí)驗(yàn)以BGC823細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)SPIN1可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)，而沉默SPIN1表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了SPIN1在胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

目前對(duì)SPIN1發(fā)揮促癌作用的分子機(jī)制研究尚在初始階段，下游只有少數(shù)靶基因被報(bào)道，更為廣泛的分子調(diào)控機(jī)制仍待研究。EMT是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，在胃癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[10]。腫瘤細(xì)胞通過(guò)發(fā)生EMT，失去上皮極性而獲得間質(zhì)特性，主要表現(xiàn)為細(xì)胞黏附分子如E-cadherin、Zo-1等表達(dá)減少，而vimentin、纖維結(jié)合蛋白等細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail家族表達(dá)異常增加等[11]。Slug是Snail鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，是EMT的重要標(biāo)志物，在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高[12]，且與胃癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在胃癌細(xì)胞系BGC823細(xì)胞中過(guò)表達(dá)/沉默SPIN1可以上調(diào)/下調(diào)Slug的表達(dá)，提示SPIN1可能通過(guò)調(diào)控Slug表達(dá)促進(jìn)EMT進(jìn)程。Claudin-1是緊密連接蛋白Claudins家族的成員之一，是重要的細(xì)胞間連接蛋白，與EMT的發(fā)生密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)Claudin-1在胃癌組織中表達(dá)明顯降低，具有抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的功能[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPIN1過(guò)表達(dá)可以抑制Claudin-1表達(dá)，而沉默SPIN1可以上調(diào)Claudin-1表達(dá)，表明SPIN1參與調(diào)控Claudin-1的表達(dá)。Martinez-Estrada等[15]研究發(fā)現(xiàn)Claudin-1是上皮細(xì)胞中Snail家族因子的直接下游靶基因。因此我們推測(cè)SPIN1對(duì)Claudin-1的調(diào)控作用可能是通過(guò)Slug實(shí)現(xiàn)的。在后續(xù)的研究中我們將繼續(xù)深入研究這一分子機(jī)制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選用胃癌BGC823細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討了SPIN1在胃癌遷移、浸潤(rùn)中的作用及其對(duì)EMT的調(diào)控作用，為胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移評(píng)估提供了新的標(biāo)志物，其更深入的分子機(jī)制有待進(jìn)一步探索。