湯永峰，張 珦，周鶴鳴，鄭燕影，李 惠

子宮內膜癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增高[1-2]。子宮內膜癌根據有無激素依賴分為兩型：Ⅰ型包括子宮內膜樣癌和黏液癌，約占子宮內膜癌的85%；Ⅱ型包括高級別漿液性癌(占3%～10%)和透明細胞癌(<2%)等。組織學分型并不能很好地反應子宮內膜癌的生物學行為和預后，需要新的分型分層標準。2013年美國癌癥基因組圖譜(TCGA)項目將子宮內膜癌分為四種分子亞型：POLE超突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定高突變型(microsatellite instability hypermutated, MSI-H)、高拷貝數型(copy number-high, CN-H)和低拷貝數型(copy number-low, CN-L)。目前關于子宮內膜癌分子分型在臨床應用的研究越來越多[3-6]，由于子宮內膜透明細胞癌(endometrial clear cell carcinoma, ECCC)病例數較少[7]，其分子分型在臨床上的應用國內尚未見報道。腫瘤免疫治療是近年研究熱點，以抗PD-1/PD-L1為代表的免疫治療在MSI-H/錯配修復缺陷(mismatch repair-deficiency, MMR-D)及高濃度腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)的腫瘤中顯示較好的療效。研究顯示：高達29%的ECCC患者為MSI，使免疫治療成為ECCC潛在的治療選擇[8]。本文旨在探討ECCC分子分型的臨床應用及其與PD-L1表達的關系，為ECCC的免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2012年1月～2019年12月南京市婦幼保健院病理科存檔的15例ECCC手術標本，所有病例均經2位高年資?？撇±磲t(yī)師確診?；颊吣挲g37～78歲，中位年齡60歲。其中5例有子宮頸浸潤，4例淋巴結有轉移。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)包埋、3 μm厚切片，采用免疫組化EnVision兩步法檢測p53、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和PD-L1(22C3)蛋白表達，PD-L1(22C3)抗體購自丹麥DAKO公司，其余抗體均購自福州邁新公司。用PBS作為陰性對照。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2陽性染色定位于細胞核，在陽性內對照(如腫瘤間質淋巴細胞)表達正常的情況下所有腫瘤細胞染色陰性判讀為MMR-D，否則為錯配修復完整(mismatch repair-proficiency, MMR-P)。p53判讀標準：大于70%的腫瘤細胞中有強的細胞核染色或腫瘤細胞染色完全陰性為p53突變型，否則為野生型。PD-L1染色結果采用CPS評分：即PD-L1染色細胞(包括腫瘤細胞、淋巴細胞、巨噬細胞)數與樣本中所有活腫瘤細胞數的比值，乘以100。陽性定義為CPS評分≥10。

1.2.2POLE基因突變檢測 常規(guī)提取、純化DNA后，將提取的DNA送至北京擎科生物公司進行Sanger測序：設計合成引物，PCR擴增后用ABI-3730xl測序儀進行測序，Data collection軟件自動進行數據處理和分析。DNA sequencing analysis 5.1軟件分析獲取測序電泳圖和序列。將樣本序列與Genebank標準序列進行比對，觀察序列有無突變。

1.3 統(tǒng)計學分析所有數據采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析；應用Fisher確切概率法進行顯著性檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ECCC中POLE突變情況按照分子篩查流程(圖1)，首先進行POLE基因測序。本組15例ECCC標本均行POLE基因突變熱點第9外顯子P286R和第13外顯子V411L點突變測序分析，均未發(fā)現病理性突變。

圖1 ECCC分子分型篩查流程

2.2 ECCC中MMR、p53蛋白表達及與臨床病理特征的關系15例ECCC中有5例(33.3%)MMR蛋白表達缺失，其中3例MLH1和PMS2表達共同缺失，缺失率為20.0%(3/15)(圖2～7)；1例MSH2和MSH6表達共同缺失，缺失率為6.7%(1/15)；1例發(fā)生4種蛋白共同缺失。15例ECCC中p53突變8例(圖8)，p53野生7例。8例p53突變中有3例MMR-D，7例p53野生中有2例MMR-D(表1)。MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、p53蛋白表達與患者腫瘤大小、年齡、浸潤深度、子宮頸浸潤及淋巴結轉移無關(P>0.05，表2)。

表1 MMR蛋白表達缺失和p53蛋白突變狀態(tài)

表2 ECCC中MMR蛋白表達缺失、p53突變與臨床病理特征的關系

2.3 不同分子分型ECCC中PD-L1的表達15例ECCC中，10例PD-L1 CPS評分≥10(圖9)，陽性率為66.7%(10/15)。與PD-L1陽性組相比，陰性組具有更深的肌層浸潤(P=0.046)、更高的淋巴結轉移率(P=0.004)，與患者年齡、腫瘤大小、有無子宮頸浸潤無關(P>0.05)。5例PD-L1陰性者均為MMR-P，10例MMR-P中PD-L1陽性率為50.0%(5/10)，而5例MMR-D中PD-L1陽性率為100.0%(5/5)。結果顯示MMR-D者PD-L1陽性比例更高，但由于病例數太少，PD-L1表達在MMR-D、MMR-P之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.084)。PD-L1表達在p53突變和野生之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.427，表3)。

表3 MMR-D、p53突變與PD-L1表達的關系

3 討論

ECCC發(fā)病率低，臨床罕見，侵襲力強，目前尚無針對性的治療指南，預后生存數據差異較大，多數報道5年生存率不足50%。鏡下腫瘤細胞可呈立方、扁平或鞋釘樣，胞質透明或嗜酸性，乳頭狀、管囊狀或實性生長方式是透明細胞癌的組織學特點。免疫組化標記ER、PR通常陰性或弱陽性，HNF-1β和Napsin A常陽性；以往將其歸類為Ⅱ型子宮內膜癌。近年研究發(fā)現，ECCC也有與Ⅰ型子宮內膜癌相似的免疫表型及基因特征，如PTEN基因突變、MMR基因表達缺陷、ARID1A表達缺失、PIK3CA變異等[9]。DeLair等[10]對32例ECCC進行免疫組化檢測及300個癌癥相關的基因測序，結果顯示11例p53異常表達、7例ARID1A表達缺失和6例MMR蛋白表達缺失。因此，尋找新的分型分層標準，更好的反應ECCC的生物學行為和預后，以及尋找新的治療方法，成為近年的研究熱點。

②③④⑤⑥⑦⑧⑨

通過TCGA對373例子宮內膜癌(307例子宮內膜樣癌和66例漿液性癌)的全基因組及轉錄組測序，結合MSI檢測結果和拷貝數分析，將子宮內膜癌分為POLE超突變、MSI-H、CN-H和CN-L四種亞型。POLE超突變是參與核DNA復制和修復的DNA聚合酶epsilon催化亞基的熱點突變，發(fā)生在約10%的子宮內膜樣癌中；MSI-H型與子宮內膜癌MMR基因改變有關；CN-H型主要包括漿液性癌，其特征是拷貝數變異大、TP53基因頻繁突變及ER、PR表達低，該亞型具有與乳腺基底樣癌和卵巢漿液性癌相同的特征；CN-L型突變率低，其中包括大多數子宮內膜樣癌，并經常與PTEN、CTNNB1、PIK3CA、ARID1A和KRAS突變相關。TCGA分子分型已應用于子宮內膜樣癌、漿液性癌和混合性癌。研究顯示：不同分子分型的子宮內膜癌患者生存差異顯著[3]，POLE超突變型預后最好，與POLE超突變型和MSI-H型相比，CN-H型和CN-L型的患者顯示出更高的轉移率和更低的5年無復發(fā)生存率。因此，有POLE突變的患者可能不需要術后輔助化療，而CN-H型患者幾乎均需要輔助化療。

子宮內膜癌TCGA分子分型程序復雜、費用貴，目前在日常工作中未得到廣泛應用。TCGA數據表明，TP53基因突變分析是區(qū)分CN-H型和CN-L型腫瘤的靈敏且特異的方法。研究者將p53免疫組化與TP53基因突變分析和熒光原位雜交進行拷貝數分析比較，發(fā)現在鑒定拷貝數方面是等效的。因此，有兩項研究[3,11]對TCGA分子分型方法進行改進，使用了更簡化、更適合臨床的替代方法，并驗證了此方法在臨床應用上的可行性。其中，Parra-Herran等[11]提出的替代方案是先用POLE基因測序篩選出POLE超突變型，再用MMR蛋白免疫組化篩選出MMR-D，最后用p53免疫組化區(qū)分p53突變型和p53野生型。Talhouk等[3]則提出ProMisE方案：先用MMR蛋白免疫組化篩選出MMR-D，MMR蛋白表達正常者再進行POLE基因測序，最后POLE野生型用p53免疫組化區(qū)分p53突變型和p53野生型。由于ProMisE方案容易將同時伴有MMR-D或p53突變型的POLE超突變型錯誤歸類為MMR-D或p53突變型，故本實驗采用先檢測POLE基因突變的方案。

TCGA中關于子宮內膜癌的數據顯示POLE超突變型占7%、MSI-H型占28%、CN-H型占26%、CN-L型占39%，但其中不包括ECCC。那么ECCC是否適用于TCGA分子分型呢？目前國外關于ECCC的TCGA分子分型研究主要有6項。2015年Hoang等[12]對14例純ECCC行基因組和免疫組化分析，結果顯示0例POLE突變、0例MSI-H、4例CN-H。Stelloo等[13]對18例ECCC行p53免疫組化、MSI和POLE突變檢測，結果顯示1例POLE突變、2例MSI-H和8例CN-H。2017年Le Gallo等[14]對16例ECCC進行腫瘤組織及對應正常組織的全外顯子組測序，對另外47例ECCC進行了22個基因測序及MSI檢測，結果顯示0例POLE突變、6例MSI-H和23例CN-H。DeLair等[10]對32例ECCC行免疫組化及300個癌癥相關的基因測序，結果顯示2例POLE突變、4例MSI-H、11例CN-H。2019年Baniak等[15]對37例ECCC通過組織芯片評估MMR蛋白、p53表達，通過二代測序評估POLE、TP53基因突變狀態(tài)，結果顯示22例CN-H，沒有發(fā)現POLE熱點突變和MMR-D病例。Travaglino等[16]將上述5項研究進行綜合分析，162例ECCC中CN-H型(42.5%)和CN-L型(40.9%)較多見，而MSI-H型(9.8%)和POLE超突變型(3.8%)較少見。由于ECCC病例數較少，本組15例標本POLE超突變型0、MMR-D/MSI-H型33.3%、p53野生型/CN-L型33.3%、p53突變型/CN-H型33.3%。在53.3%(8/15)的病例中p53蛋白異常表達，提示其突變譜似乎更像漿液性癌。但是有3例同時表現為MMR-D，所以p53突變型為33.3%(5/15)；本實驗未檢出POLE突變，可能是由于本實驗僅進行了P286R和V411L最常見的2個熱點突變檢測，而未進行全外顯子測序。

晚期ECCC治療難度大、病死率高，需尋找有效的標志物和治療方法，抗PD-1/PD-L1免疫治療成為新的希望。ECCC中PD-L1陽性率26.5%～76%[17-18]。關于PD-L1與子宮內膜癌預后關系的報道尚不統(tǒng)一。Jin等[19]應用免疫組化法檢測23例ECCC中PD-1和PD-L1(SP142)的表達，結果顯示PD-1/PD-L1陽性組具有更高的FIGO分級、更深的肌層浸潤，提示患者預后不佳，差異無統(tǒng)計學意義。Yamashita等[20]對149例子宮內膜癌行PD-1/PD-L1檢測，結果顯示PD-L1陽性患者的無進展生存期顯著延長。本組結果顯示PD-L1(22C3)陰性組具有更深的肌層浸潤、更高的淋巴結轉移率，與Jin等報道的不一致，是否和人群異質性或使用不同的抗體有關需要進一步分析。目前認為MSI-H/MMR-D病例PD-1和PD-L1的表達更高，提示免疫檢查點抑制劑在MSI-H/MMR-D病例中可能更有效。本實驗結果顯示，在ECCC中MMR-D組與MMR-P相比，PD-L1的表達呈更高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，需要收集更多標本進一步研究。

本實驗初步展示了ECCC的分子異質性，顯示ECCC部分與子宮內膜樣癌相似，部分與漿液性癌相似，總體突變譜似乎比子宮內膜樣癌更像漿液性癌。由于病例數較少，需擴大樣本對ECCC的分子機制進行單獨的研究，以明確ECCC是否可以根據TCGA分子標記細分為不同的子類別，以及這些類別是否具有不同的形態(tài)特征和治療選擇。