朱婷婷，胡青芳，劉學(xué)玉，孫德剛，辛秉昌，高嫘娜

人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)是一類與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著極其相似的免疫表型及形成礦化結(jié)節(jié)能力的細(xì)胞，可自我更新和多向分化[1]。同時(shí)，hDPSCs容易培養(yǎng)和低免疫原性，被認(rèn)為是組織工程學(xué)理想的種子細(xì)胞，目前其不僅應(yīng)用于牙齒相關(guān)疾病[2]，還可以用于糖尿病、心臟疾病和關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[3-5]。然而，hDPSCs經(jīng)體外長期培養(yǎng)易發(fā)生衰老，影響其增殖速度、多向分化潛能，進(jìn)而限制其后續(xù)應(yīng)用[6]。因此，探究hDPSCs的衰老機(jī)制，探索hDPSCs發(fā)生衰老過程中關(guān)鍵作用因子，對(duì)于增強(qiáng)hDPSCs的穩(wěn)定性和拓展其臨床應(yīng)用前景具有重要意義。

近期研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)參與調(diào)控hDPSCs的衰老及分化過程[7-9]。如，在衰老hDPSCs中l(wèi)ncRNA FAM96B低表達(dá)，而過表達(dá)lncRNA FAM96B后可明顯減少SA-β-gal陽性細(xì)胞數(shù)、增強(qiáng)hDPSCs礦化能力以及促進(jìn)其成骨分化[9]。另外，lncRNA母源性印記基因3(maternal imprinting gene 3, MEG3)異常表達(dá)與人脂肪干細(xì)胞衰老密切相關(guān)[10]，然而lncRNA MEG3對(duì)hDPSCs衰老的作用機(jī)制尚未有研究證實(shí)。為此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過分析經(jīng)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)處理后hDPSCs衰老過程中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)量的變化規(guī)律，闡明lncRNA MEG3與hDPSCs衰老的關(guān)系，為研究hDPSCs衰老的相關(guān)調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以及對(duì)牙齒相關(guān)疾病的細(xì)胞治療提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素、LPS和SA-β-gal溶液均購于美國Sigma-Aldrich公司；lncRNA MEG3 shRNA(sh-MEG3)、ROCK1 siRNA(si-ROCK1)、pcDNA3.1-ROCK1(OE-ROCK1)及空白質(zhì)粒均由中國GeneChem公司構(gòu)建；Trizol試劑盒和RIPA裂解液均購于天根生化科技(北京)公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；SYBR GREEN Master Mix Kit購于北京索萊寶科技公司；Prime-ScriptTM試劑盒購于日本Takara公司；BCA試劑盒購自北京百奧萊博科技公司；ROCK1、p53和p21抗體均購自美國Abcam公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國賽默飛公司；顯微鏡購自德國萊卡公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-rad公司；酶標(biāo)儀購自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

1.2 方法

1.2.1hDPSCs細(xì)胞分離培養(yǎng) 收集青島市口腔醫(yī)院健康志愿者(年齡18～24歲)拔除的完整、無齲壞的第三磨牙15顆，75%乙醇消毒后，用裂鉆將牙齒沿牙頸部截?cái)?，劈開牙冠打開牙髓腔，取出牙髓組織，PBS清洗，切成1 mm3的碎片。0.3%Ⅰ型膠原酶和0.4%分散酶37 ℃消化45 min后，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基中止消化，收集懸液，1 000 r/min離心5 min，加入含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素及鏈霉素的DMEM重懸，并置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。每隔48 h更換1次新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞生長至密度為80%時(shí)進(jìn)行傳代，本實(shí)驗(yàn)中所用hDPSCs細(xì)胞為第三代。通過流式細(xì)胞儀對(duì)所分離細(xì)胞表面分子CD34、CD44、CD45、CD80、CD90和CD105的表達(dá)水平鑒定分離細(xì)胞確認(rèn)為hDPSCs細(xì)胞[11]。本實(shí)驗(yàn)由青島市口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，志愿者均簽署知情同意書。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將上述分離純化的hDPSCs培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度到70%～80%時(shí)按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將sh-MEG3、sh-NC、si-ROCK1、OE-ROCK1、si-NC以及OE-NC分別轉(zhuǎn)染至hDPSCs，并于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h待用，并采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3LPS誘導(dǎo)hDPSCs衰老 將細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于6孔板，培養(yǎng)144 h，培養(yǎng)過程中使用10 ng/mL LPS刺激hDPSCs，分別刺激1次(處理時(shí)間6 h)、3次(每隔48 h經(jīng)LPS處理6 h)、6次(每隔24 h經(jīng)LPS處理6 h)，以生理鹽水組為對(duì)照組。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)lncRNA MEG3的表達(dá)水平 使用Trizol Reagent分別提取經(jīng)處理后的hDPSCs內(nèi)總RNA，用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將全部RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，合計(jì)30個(gè)循環(huán)。lncRNA MEG3正向引物5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，反向引物5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物5′-CAAGATCATCAG CAATGCCT-3′，反向引物5′-ATGGACTGTGGTCAT GAGT-3′。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA MEG3的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Western blot法檢測(cè)ROCK1、p53和p21蛋白的表達(dá) 收集各組待測(cè)hDPSCs，PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液，37 ℃水浴30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組用等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶，并用電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，后和一抗ROCK1(1 ∶2 000)、p53(1 ∶1 000)和p21(1 ∶1 000)在4 ℃孵育過夜；次日，TBST洗滌3次，將膜加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h；TBST洗滌3次后加入ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，然后在凝膠成像儀上拍照顯影，采用Image J灰度分析軟件分析灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色檢測(cè)細(xì)胞衰老 將經(jīng)處理后的hDPSCs接種于新的6孔板，于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)48 h；吸除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌，每孔加入SA-β-gal染色固定液1 mL，室溫下靜置固定15 min；去除細(xì)胞固定液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3 min，洗滌3遍；配置染色工作液，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃孵育過夜；次日光學(xué)顯微鏡下觀察。陽性細(xì)胞染色后呈藍(lán)綠色，陰性細(xì)胞不被染色；顯微鏡下各組選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和SA-β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)hDPSCs衰老過程中l(wèi)ncRNA MEG3和ROCK1的表達(dá)水平qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，LPS處理hDPSCs后可顯著上調(diào)lncRNA MEG3的表達(dá)水平，且在LPS處理6次時(shí)，lncRNA MEG3的表達(dá)水平最高(P<0.001，圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA MEG3在LPS處理hDPSCs不同次數(shù)后的表達(dá)水平：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS處理hDPSCs后衰老相關(guān)蛋白(p53和p21)以及ROCK1的表達(dá)水平均升高，且隨著處理次數(shù)的增加，上調(diào)效應(yīng)也逐漸增強(qiáng)，尤其是作用6次后衰老相關(guān)蛋白及ROCK1的表達(dá)水平最高(P<0.001，圖2)。這些結(jié)果表明，在LPS處理6次后可顯著誘導(dǎo)hDPSCs衰老，且上調(diào)了lncRNA MEG3和ROCK1的表達(dá)水平。

圖2 Western blot法檢測(cè)ROCK1和衰老相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá)水平：A.電泳圖；B.柱狀圖；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 敲降lncRNA MEG3對(duì)LPS誘導(dǎo)hDPSCs衰老的影響基于LPS處理hDPSCs后lncRNA MEG3表達(dá)上調(diào)，為進(jìn)一步探討lncRNA MEG3在LPS誘導(dǎo)hDPSCs衰老的作用，采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率結(jié)果顯示，相比于sh-NC組，轉(zhuǎn)染sh-MEG3于hDPSCs中可顯著下調(diào)lncRNA MEG3的表達(dá)水平(0.95±0.17vs0.39±0.13，P<0.01)。同時(shí)，相比于sh-NC組，敲降lncRNA MEG3(sh-MEG3組)后可顯著下調(diào)未用LPS處理的對(duì)照組和LPS處理6次組中hDPSCs衰老相關(guān)蛋白(p53和p21)的表達(dá)(P<0.05，圖3)。

圖3 Western blot法檢測(cè)敲降lncRNA MEG3對(duì)LPS誘導(dǎo)hDPSCs衰老相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響：A.電泳圖；B.柱狀圖；*P<0.05，**P<0.01

進(jìn)一步采用SA-β-gal染色檢測(cè)敲降lncRNA MEG3對(duì)LPS誘導(dǎo)hDPSCs衰老的影響(圖4)。在未用LPS處理的hDPSCs對(duì)照組中，對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)、sh-NC組和sh-MEG3組SA-β-gal陽性細(xì)胞率(%)分別為27.31±3.61、26.69±2.73和8.44±4.8；LPS處理6次組中，各分組的SA-β-gal陽性細(xì)胞率(%)分別為38.24±8、35.33±4.3和12.53±2.88。在未用LPS處理的對(duì)照組和LPS處理6次組中，sh-MEG3組的SA-β-gal陽性細(xì)胞率均低于sh-NC組(P<0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，敲降lncRNA MEG3可顯著緩解LPS誘導(dǎo)的hDPSCs衰老。

對(duì)照組sh-NCsh-MEG3未處理組LPS處理6次

2.3 敲降ROCK1緩解LPS誘導(dǎo)的hDPSCs衰老進(jìn)一步分析敲降ROCK1對(duì)LPS誘導(dǎo)hDPSCs衰老的影響。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于si-NC組，敲降ROCK1(si-ROCK1組)顯著下調(diào)ROCK1在未用LPS處理的對(duì)照組和LPS處理6次組hDPSCs中的表達(dá)水平(P<0.01，圖5)。同時(shí)，敲降ROCK1顯著下調(diào)衰老相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá)水平(P<0.05，圖5)。

圖5 Western blot法檢測(cè)敲降ROCK1對(duì)LPS誘導(dǎo)hDPSCs衰老相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響：A.電泳圖；B.柱狀圖；*P<0.05，**P<0.01

SA-β-gal染色結(jié)果顯示，在未用LPS處理的對(duì)照組中，對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)、si-NC組和si-ROCK1組SA-β-gal陽性細(xì)胞率(%)分別為25.36±3.9、31.69±4.41和6.17±6.07；LPS處理6次組中，各分組的SA-β-gal陽性細(xì)胞率(%)分別為33.22±3.73、32.78±6.04和15.08±2.3。在未用LPS處理的對(duì)照組和LPS處理6次組中，si-ROCK1組的SA-β-gal陽性細(xì)胞率均低于si-NC組(P<0.01，圖6)。由此可知，敲降ROCK1可顯著緩解LPS誘導(dǎo)的hDPSCs衰老。

對(duì)照組si-NCsi-ROCK1未處理組LPS處理6次

2.4 敲降lncRNA MEG3通過下調(diào)ROCK1緩解LPS誘導(dǎo)的hDPSCs衰老上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)敲降lncRNA MEG3或ROCK1可顯著緩解LPS誘導(dǎo)的hDPSCs衰老。為進(jìn)一步探討lncRNA MEG3是否通過ROCK1介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的hDPSCs衰老。Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，相比于僅過表達(dá)ROCK1(OE-ROCK1組)，ROCK1在sh-MEG3 + OE-ROCK1組中的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)。同時(shí)，僅過表達(dá)ROCK1可顯著上調(diào)LPS處理hDPSCs中衰老相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá)水平(P<0.05)，但同時(shí)敲降lncRNA MEG3(sh-MEG3+OE-ROCK1組)可明顯下調(diào)過表達(dá)ROCK1對(duì)LPS處理hDPSCs中衰老相關(guān)蛋白的促進(jìn)作用(P<0.01，圖7)。

圖7 Western blot法檢測(cè)單獨(dú)過表達(dá)ROCK1或同時(shí)過表達(dá)ROCK1并敲降lncRNA MEG3后ROCK1和衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)水平：A.電泳圖；B.柱狀圖；*P<0.05，**P<0.01

SA-β-gal染色結(jié)果顯示，在未用LPS處理的對(duì)照組中，對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)、OE-NC組、OE-ROCK1組和sh-MEG3+OE-ROCK1組SA-β-gal陽性細(xì)胞率(%)分別為28.83±3.56、25.11±4.56、37.04±2.87和22.2±2.79；LPS處理6次組中，各分組的SA-β-gal陽性細(xì)胞率(%)分別為35.11±5.44、36.81±6.03、51.28±3.24和28.84±5.89。在未用LPS處理的對(duì)照組和LPS處理6次組中，過表達(dá)ROCK1較OE-NC組可顯著上調(diào)hDPSCs中SA-β-gal陽性細(xì)胞數(shù)(P<0.05)，但同時(shí)敲降lncRNA MEG3可顯著下調(diào)ROCK1單獨(dú)過表達(dá)的作用效果(P<0.01，圖8)?？梢?，敲降lncRNA MEG3可能通過抑制ROCK1的表達(dá)水平，進(jìn)而緩解LPS誘導(dǎo)hDPSCs的衰老。

對(duì)照組OE-NCOE-ROCK1sh-MEG3+OE-ROCK1對(duì)照組LPS處理6次

3 討論

lncRNA是非編碼RNA的重要組成部分，其長度大于200個(gè)核苷酸，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、劑量補(bǔ)償效應(yīng)等作用[12-13]。其中，lncRNA MEG3是一種多效的lncRNA，參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移等，且在多種腫瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)[14]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3也參與細(xì)胞衰老。如lncRNA MEG3能夠抑制小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖，并促進(jìn)卵巢功能早衰[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，lncRNA MEG3在LPS處理后的hDPSCs中高表達(dá)，且敲降lncRNA MEG3后可明顯抑制LPS誘導(dǎo)hDPSCs中衰老相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá)水平，同時(shí)也下調(diào)了SA-β-gal陽性細(xì)胞數(shù)。機(jī)制上，敲降lncRNA MEG3通過下調(diào)ROCK1緩解LPS誘導(dǎo)的hDPSCs衰老。

ROCK1是一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，是GTPase RhoA的主要下游效應(yīng)因子，并且是細(xì)胞骨架中產(chǎn)生收縮力的肌球蛋白的調(diào)節(jié)因子。ROCK1在癌癥、特定細(xì)胞活力、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、血管新生等方面具有重要作用[16]。有研究證實(shí)，ROCK1在肌腱干細(xì)胞衰老細(xì)胞中高表達(dá)，且敲降ROCK1可顯著誘導(dǎo)年青人肌腱干細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)移行和腱分化[17]。Chen等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，ROCK1在衰老加速傾向的小鼠中過表達(dá)。Scott等[19]發(fā)現(xiàn)，ROCK1抑制劑能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞衰老。然而，ROCK1對(duì)hDPSCs衰老的影響卻鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首先用LPS處理hDPSCs誘導(dǎo)其衰老，根據(jù)處理次數(shù)不同，設(shè)立1、3、6次三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，隨著LPS處理次數(shù)增加，各組細(xì)胞中ROCK1和衰老相關(guān)蛋白(p53和p21)的表達(dá)水平都在逐漸上調(diào)。研究結(jié)果提示，ROCK1異常高表達(dá)與hDPSCs衰老有關(guān)。p53/p21已被證實(shí)是調(diào)控細(xì)胞衰老的重要分子，p53/p21過表達(dá)與細(xì)胞周期、凋亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[20-22]。也有研究證實(shí)，p53/p21通路在細(xì)胞衰老過程中被激活[23-24]。因此在本實(shí)驗(yàn)中，選擇p53、p21作為檢測(cè)hDPSCs衰老過程的重要標(biāo)志因子。為進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA MEG3是否通過ROCK1對(duì)hDPSCs衰老起調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)在hDPSCs中過表達(dá)ROCK1并敲降lncRNA MEG3，結(jié)果顯示過表達(dá)ROCK1組p53、p21表達(dá)明顯上調(diào)，hDPSCs衰老細(xì)胞明顯增加；相反，敲降lncRNA MEG3明顯下調(diào)了過表達(dá)ROCK1對(duì)hDPSCs衰老的促進(jìn)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)lncRNA MEG3/ROCK1分子軸是hDPSCs衰老過程中重要信號(hào)通路調(diào)控因子。敲降lncRNA MEG3可通過下調(diào)ROCK1表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的hDPSCs衰老。本實(shí)驗(yàn)解釋了hDPSCs衰老的潛在發(fā)生機(jī)制，也為hDPSCs在細(xì)胞治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。