翟博雅，龔予希，楊野梵，張 響，張智弘

乳腺癌是全球女性腫瘤死亡的主要原因之一，其發(fā)病的分子機(jī)制復(fù)雜。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在很長一段時(shí)間內(nèi)均被認(rèn)為是一種“轉(zhuǎn)錄噪音”，近十年來隨著人們對(duì)非編碼RNA的認(rèn)知深入，lncRNA在人體內(nèi)的調(diào)控作用才逐漸被重視。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA、mRNA、環(huán)狀RNA(circRNA)、假基因等通過競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)機(jī)制互相作用，形成ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，干擾許多因子的表達(dá)影響疾病的整體進(jìn)程。本文現(xiàn)就lncRNA通過ceRNA調(diào)控機(jī)制在乳腺癌中發(fā)揮作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ceRNA調(diào)控機(jī)制

ceRNA假說由Salmena等[1]于2011年首次提出，假說以微小核糖核酸(microRNA, miRNA)為核心展開，其中心內(nèi)容：除了傳統(tǒng)的miRNA對(duì)mRNA作用之外，還存在RNA調(diào)控miRNA作用方式，即RNA分子之間可以雙向調(diào)控。mRNA、lncRNA、假基因與真基因的基因組序列相似的非功能性DNA拷貝)等在體內(nèi)并非處于互不干擾的狀態(tài)，而是可以通過某種特殊的“語言”進(jìn)行交流。miRNA反應(yīng)元件(miRNA response elements, MREs)是各種類型RNA上可以被miRNA結(jié)合的小片段序列，當(dāng)mRNA、lncRNA、假基因上有相同的MREs時(shí)，它們就能夠和同一種miRNA結(jié)合，此時(shí)這些不同類型的RNA就可以競爭miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，它們之間互為ceRNA。不同種類的RNA通過MREs這種新的“語言”相互“交流”，形成一張大規(guī)模ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而影響癌癥發(fā)生、物質(zhì)代謝等一系列的生物活動(dòng)。作為ceRNA網(wǎng)絡(luò)的中心，miRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其可以與靶基因的互補(bǔ)序列區(qū)域結(jié)合，從而降低靶基因的穩(wěn)定性或者限制它們的翻譯[2]；miRNA通常被認(rèn)為是活躍的調(diào)控元件，當(dāng)處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的miRNA表達(dá)水平變化時(shí)，就會(huì)對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤微血管形成、細(xì)胞自噬、糖脂代謝、細(xì)胞分化等產(chǎn)生影響[3]。此外，該假說認(rèn)為所有類型的RNA，如lncRNA、mRNA、circRNA、假基因均可以競爭miRNA，因此ceRNA并非是一種RNA類型，而是一種RNA調(diào)控機(jī)制(圖1)。

圖1 lncRNA、mRNA、circRNA、假基因均可以結(jié)合miRNA，彼此互為ceRNA

2 lncRNA與miRNA的互相作用機(jī)制

lncRNA是一類長度大于200 nt的不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA。lncRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多種生命調(diào)控作用，如與轉(zhuǎn)錄因子相互作用參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、影響mRNA功能參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)及翻譯調(diào)控、修飾染色體參與表觀調(diào)節(jié)等，從而導(dǎo)致包括腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[4-7]。

lncRNA常常在腫瘤和正常組織中差異表達(dá)，導(dǎo)致這種差異表達(dá)的因素很多[8-9]。當(dāng)lncRNA作為ceRNA時(shí)，能夠與miRNA結(jié)合，“占用”其MREs。當(dāng)體內(nèi)lncRNA的含量升高時(shí)，所結(jié)合的miRNA增多，miRNA與下游靶基因的結(jié)合位點(diǎn)減少，下游靶基因表達(dá)增加；反之，當(dāng)體內(nèi)lncRNA表達(dá)水平降低時(shí)，靶miRNA上的結(jié)合位點(diǎn)空出，更多下游靶基因就能夠與該miRNA結(jié)合，體內(nèi)能夠檢測到的下游靶基因含量就會(huì)減少。即有相同MREs的兩種RNA表達(dá)趨勢是一致的(圖2)。當(dāng)RNA發(fā)揮這種作用時(shí)也被稱為“分子海綿”作用。值得注意的是，一個(gè)miRNA上可以存在多個(gè)RNA結(jié)合靶點(diǎn)，而一種lncRNA也可以和多種miRNA結(jié)合，此時(shí)涉及的基因更多，機(jī)制更加復(fù)雜[10]。ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各因子的合作有助于協(xié)調(diào)許多生物學(xué)過程。若靶基因與lncRNA結(jié)合的miRNA或與lncRNA有相同MREs的RNA參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展，那么lncRNA的含量變化就會(huì)影響疾病進(jìn)程。

圖2 有共同MREs的RNAs表達(dá)趨勢一致

3 lncRNA通過ceRNA調(diào)控機(jī)制在乳腺癌中發(fā)揮的作用

WHO針對(duì)全球癌癥發(fā)病情況的報(bào)告指出：乳腺腫瘤是導(dǎo)致女性因癌癥死亡的常見腫瘤之一[11]。因此，對(duì)乳腺癌的病因、發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究有著重要的意義。

3.1 ceRNA網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用lncRNA在細(xì)胞內(nèi)具有重要的調(diào)控作用，參與了腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、遷移等過程[12](圖3)。Chi等[13]的研究結(jié)果表明，lncRNA SNHG5是乳腺癌中的致癌基因和潛在的乳腺癌預(yù)測標(biāo)志物，其作為miR-154-5p的“分子海綿”，削弱了miR-154-5p對(duì)靶基因PCNA的抑制作用，加強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖，提示了ceRNA在乳腺癌增殖中的作用。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)雄激素受體(AR)陽性的三陰型乳腺癌患者預(yù)后比AR陰性患者更好，他們發(fā)現(xiàn)一種AR陰性誘導(dǎo)的lncRNA ARNILA，計(jì)算機(jī)預(yù)測和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)均顯示ARNILA上存在miR-204的直接結(jié)合位點(diǎn)，miR-204能夠和參與乳腺癌EMT的Sox4結(jié)合，即ARNILA作為ceRNA使miR-204加強(qiáng)Sox4的表達(dá)；反之，敲降A(chǔ)RNILA減少了Sox4及其蛋白表達(dá)水平。通過間接調(diào)控Sox4，ARNILA參與了乳腺癌的EMT過程，并促進(jìn)了乳腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)可塑性介導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移性，通過EMT和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition, MET)，癌細(xì)胞可以在上皮和間質(zhì)兩種表型間轉(zhuǎn)化[15-16]。Zhou等[17]構(gòu)建了小鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌模型研究lncRNA H19對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。作者發(fā)現(xiàn)H19在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中高表達(dá)，小鼠GIT2基因是miR-200b/c的靶基因，而miR-200b/c對(duì)維持上皮表型有重要作用，作者用計(jì)算機(jī)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)均證實(shí)H19與miR-200b/c存在結(jié)合位點(diǎn)；當(dāng)敲降H19后，miR-200b/c的豐度沒有改變，但減少了細(xì)胞中GIT2的表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)了H19作為ceRNA調(diào)控miR-200b/c在細(xì)胞中發(fā)揮作用。此外，作者還發(fā)現(xiàn)H19充當(dāng)了不止一個(gè)ceRNA作用，其同樣可以與miRNA let-7結(jié)合，與GIT2和CYTH3互為ceRNA，調(diào)控癌細(xì)胞的EMT，影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

圖3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用

3.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌耐藥中的作用手術(shù)治療是早期乳腺癌患者的一線治療方案，對(duì)于中晚期患者，藥物治療是必不可少的，但耐藥往往是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因之一(圖4)。Dong等[18]發(fā)現(xiàn)，lncRNA TINCR在耐曲妥珠單抗乳腺癌患者中高表達(dá)，且與患者預(yù)后相關(guān)，其與HER-2互為ceRNA，共同競爭miR-125b上的結(jié)合位點(diǎn)，沉默miR-125b表達(dá)以促進(jìn)HER-2表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌患者對(duì)曲妥珠單抗耐藥，同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞中EMT；敲降TINCER后miR-125b表達(dá)增加，HER-2表達(dá)降低。這表明TINCER可以作為miR-125b調(diào)節(jié)HER-2表達(dá)的“分子海綿”。研究還發(fā)現(xiàn)mRNA Snail-1同樣是miR-125b的下游靶基因，過表達(dá)miR-125b顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞中Snail的表達(dá)；使用miR-125b抑制劑后結(jié)果相反，即在耐曲妥珠單抗過程中，mRNA Snail-1是TINCER/miR-125b的功能性靶點(diǎn)；lncRNA TINCER可能是HER-2陽性患者的潛在治療靶點(diǎn)。Gu等[19]發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5在HER-2陽性患者和耐他莫昔芬乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，其下調(diào)會(huì)導(dǎo)致患者預(yù)后變差。有研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，miR-222是GAS5的下游靶標(biāo)，且受GAS5的負(fù)向調(diào)控。通過競爭性結(jié)合miR-222，GAS5上調(diào)PTEN表達(dá)，而PTEN基因是已知的調(diào)控乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬敏感性的藥物。敲降GAS5可以在乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)拉帕替尼誘導(dǎo)抑制的PTEN表達(dá)，上調(diào)GAS5則可以使之通過分子海綿的作用調(diào)控miR-222加強(qiáng)對(duì)他莫昔芬等的敏感性。Yao等[22]發(fā)現(xiàn)lncRNA NONHSAT101069在乳腺癌組織和細(xì)胞中上調(diào)，且與miR-129-5p結(jié)合，miR-129-5p在乳腺癌組織中比癌旁組織含量更低；敲降NONHSAT101069后miR-129-5p的含量增加。Twist1是miR-129-5p的下游靶蛋白，其是調(diào)控EMT的關(guān)鍵因子且促進(jìn)乳腺癌對(duì)表柔比星的耐藥、遷移、侵襲。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NONHSAT101069/miR-129-5p軸確實(shí)可以作用于Twist1，從而加強(qiáng)乳腺癌的耐藥。

圖4 ceRNA網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌耐藥中的作用

4 展望

Abdollahzadeh等[23]首次引入了“ceRnome”作為ceRNA研究的一個(gè)新術(shù)語，描述細(xì)胞或組織內(nèi)所有參與病理生理過程的RNA分子的聚集現(xiàn)象，旨在說明各種分子作為一個(gè)整體影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。lncRNA作為“分子海綿”在體內(nèi)影響了眾多因子的表達(dá)變化，從而影響了包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的進(jìn)展。但lncRNA作為ceRNA網(wǎng)絡(luò)的意義不僅在此，Olgun等[24]對(duì)多名患者的基因表達(dá)譜進(jìn)行數(shù)學(xué)分析和測試，發(fā)現(xiàn)lncRNA在不同亞型乳腺癌中會(huì)充當(dāng)特定的海綿作用，將患者根據(jù)特定的ceRNA互相作用機(jī)制的表達(dá)模式分組，其生存分布差異有顯著性；而若僅僅依據(jù)參與ceRNA網(wǎng)絡(luò)的單個(gè)RNA表達(dá)情況進(jìn)行分組，結(jié)果則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明ceRNA網(wǎng)絡(luò)有助于對(duì)乳腺癌進(jìn)行新分型并進(jìn)一步闡明各種亞型獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制，該方法對(duì)于其他類型的腫瘤也具有借鑒作用，有廣泛的適用性。

雖然有大量實(shí)驗(yàn)佐證了ceRNA網(wǎng)絡(luò)的重要性，但同樣不能忽視的是，對(duì)于ceRNA網(wǎng)絡(luò)也存在一些質(zhì)疑的聲音[25]。對(duì)于ceRNA假說質(zhì)疑的主要論點(diǎn)：單個(gè)miRNA靶標(biāo)表達(dá)的任何變化都可能僅占靶標(biāo)位點(diǎn)豐度的小部分，即單個(gè)lncRNA表達(dá)變化不足以抑制miRNA活性[26-27]。

總之，ceRNA網(wǎng)絡(luò)作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)的可能機(jī)制被廣泛接受并得到了初步承認(rèn)，發(fā)現(xiàn)新的RNA及其在疾病進(jìn)程中的作用機(jī)制，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物和開發(fā)新藥物有積極作用，拓展了新的研究領(lǐng)域。隨著人們對(duì)lncRNA、miRNA、mRNA、假基因等功能的進(jìn)一步探究，對(duì)于ceRNA的認(rèn)識(shí)可能會(huì)更加客觀和全面。