胡克特，張 萍，陳榮祥,3，顧 丁

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563099；2遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,貴州 遵義 563000；3遵義市理化分析測試工程技術(shù)研究中心，貴州 遵義 563000)

鹽膚木(RhuschinensisMills)為漆樹科鹽膚木屬(Rhus)落葉小喬木，是我國重要的林業(yè)經(jīng)濟(jì)植物[1]，其莖和根常用于制作中藥[2-3]，鹽膚木葉具有化痰止咳，收斂，刺激血液循環(huán)等功效[4-6]；我國重要的中藥材五倍子是由癭綿蚜科某些昆蟲寄生于幾種鹽膚木屬植物復(fù)葉上而形成的癭瘤[7]。五倍子所含酚類化合物是一種具有諸多用途的天然產(chǎn)物，常被用作醫(yī)療與化工原料[8-10]，具有抗炎、抗輻射、抗腫瘤等生物活性[11-13]，例如，其中的沒食子酸具有改善腦缺血再灌注損傷，改善心衰的心功能障礙和纖維化的功能[14-15]。目前，五倍子多酚獲取途徑比較單一，即主要依賴五倍子進(jìn)行提??；然而，近年來，由于生態(tài)環(huán)境遭到破壞，導(dǎo)致自然生長的蟲癭越來越少，從而使五倍子的產(chǎn)量逐年降低，進(jìn)而無法滿足相應(yīng)的市場需求[16]。較五倍子而言，鹽膚木葉片的資源相對豐富且易于獲得，并且研究發(fā)現(xiàn)其中含有一定量的五倍子多酚類物質(zhì)，但其含量遠(yuǎn)小于五倍子[17-19]。盡管如此，若能充分利用鹽膚木葉片提取酚類物質(zhì)，或?yàn)榻鉀Q五倍子短缺的問題提供了一種可能的途徑。因此，為了解鹽膚木葉片藥用成分的積累特征，本研究測定了自然條件下生長的鹽膚木葉片的總酚含量及其它藥用成分的含量，以期確定其最佳采摘時(shí)節(jié)和葉齡。同時(shí)，本研究還對其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Lambda265 紫外可見分光光度儀(鉑金埃爾默儀器有限公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；UltiMate 3000 Bio—RS型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；ME104/2萬分之一電子天平(梅特勒-托利多)；Chorus純水及超純水系統(tǒng)(英國埃爾格)；5B—5200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

福林酚(Folin，CAS:12111-13-6，飛凈生物科技有限公司)；甲醇、乙腈、檸檬酸(色譜純，阿拉丁生化科技股份有限公司)；沒食子酸、沒食子酸甲酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸乙酯、表兒茶素沒食子酸酯、根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 植物材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料及其處理 供試植物，選取位于貴州省遵義市(北緯N27°43′24.19″，東經(jīng)E107°04′24.08)的野生鹽膚木。

于2019年5月中旬到9月中旬，測定3株鹽膚木的葉片的總酚變化情況；3株樹齡在3年以上，每月每株樹上隨機(jī)選擇3根樹枝采摘3組葉片，每組采20片葉片；共測定45次總酚含量。采摘葉片時(shí)，選取完整的和無病蟲害的葉片。

于2020年6月8日采摘12株樹葉片，其中9株，樹齡為3年期，另3株為1年期。每株樹取1整條枝的葉，枝條末端1/3為新生嫩葉片，中部1/3為中等嫩葉片，下部1/3為較老葉片；每組10片葉片，測量多酚、類黃酮、總酚含量，共測量36次。所采摘的葉片均先放入120℃烘箱內(nèi)進(jìn)行殺青15～20 min，然后于60℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎，過80目篩，備用。

1.2.2 多酚提取 精確稱取0.1 g鹽膚木葉片粉末，采用80%甲醇溶液超聲提取多酚。提取條件：料液比1∶100(g/mL)，在16 ℃水中，超聲提取50 min，冷卻，取1 mL于EP管中在12 000 r/min離心10 min，取上清，然后0.22 μm濾膜過濾。

1.2.3 條件優(yōu)化 在不同提取條件下，對同一份鹽膚木葉的總酚進(jìn)行提取，并對其含量進(jìn)行測定；提取時(shí)，超聲溫度均為16 ℃，其余試驗(yàn)因素設(shè)置見表1。

表1 單因素試驗(yàn)表

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 取沒食子酸、沒食子酸甲酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸乙酯、表兒茶素沒食子酸酯、根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品并配成濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再將其梯度稀釋成濃度為10、20、50、80、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.5 總酚測定 提取方法采用1.2.2的方法，稀釋10倍，采用福林法[20]，取樣品液0.5 mL，加入0.25 mol/L 福林酚試劑0.5 mL，混合，靜置3 min，再加入15% Na2CO31 mL混合，靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，以未加樣品的對照組為空白，測定760 nm吸光度。

1.2.6 多酚及類黃酮測定 采用色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm ,1.8 μm)；流動(dòng)相條件：50 mmol/L檸檬酸鹽溶液(pH 2.9)與甲醇，按以下梯度洗脫：0～14.5 min，10%～35%檸檬酸鹽溶液; 之后采用40% 檸檬酸鹽沖洗2 min后回到初始梯度并平衡4 min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積1 μL。DAD檢測波長275 nm。

2 結(jié)果

2.1 總酚提取條件的優(yōu)化

2.1.1 料液比優(yōu)化 由圖1可知，鹽膚木葉總酚的獲取率隨著料液比的增加而提高，但當(dāng)料液比超過1∶50(g/mL)時(shí)，總酚提取率趨于穩(wěn)定，這可能是因?yàn)闃悠匪偡尤咳苡诩状既芤汉?，總酚提取率便不再隨甲醇溶劑量的增加而提高。由于1∶100(g/mL)獲取率最高，在之后測定中僅用稀釋一次，故選取1∶100(g/mL)為最佳料液比。

圖1 不同料液比下鹽膚木樣品中總酚的獲取率變化趨勢

2.1.2 超聲時(shí)間優(yōu)化 由圖2可見，總酚提取率隨超聲時(shí)間的增加而升高，當(dāng)單次超聲時(shí)間為50 min時(shí)，總酚提取率達(dá)到峰值；之后，總酚提取率便不再隨著超聲時(shí)間延長而升高，可能因?yàn)槭怯捎诔暡ǖ膿羲楹蜔嵝?yīng)導(dǎo)致某些多酚成分分解[21]。因此，超聲提取時(shí)間可定為50 min。

圖2 不同超聲時(shí)間下鹽膚木樣品中酚類化合物的變化趨勢

2.1.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化 由圖3可見，總酚提取率隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，總酚的提取率可達(dá)到最大；但當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，總酚獲取率反而下降。因此，甲醇體積分?jǐn)?shù)可選為80%。

圖3 不同甲醇的體積分?jǐn)?shù)下鹽膚木樣品中酚類化合物的變化趨勢

綜上所述，料液比1∶100(g/mL)，超聲時(shí)間為50 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，可得到最高的多酚獲取率。

2.2 鹽膚木葉片總酚含量隨季節(jié)變化 由圖4可見，3株3年期鹽膚木葉片的總酚含量大致在3%～12%；從5月中旬至7月中旬鹽膚木葉片的總酚含量呈上升趨勢，并在7月達(dá)到峰值，之后，則呈下降趨勢；鹽膚木葉片的總酚含量在相同月份內(nèi)無顯著差異(P>0.05)，而不同月份間有顯著差異(P<0.05)；這表明鹽膚木葉片的總酚含量具有季節(jié)性變化。

圖4 3年期鹽膚木葉片總酚含量的變化

2.3 不同老嫩葉片化學(xué)成分的含量測定和分析 采用上述優(yōu)化的提取條件對12株鹽膚木的不同老嫩程度葉片的成分進(jìn)行提取，并采用液相色譜對提取物進(jìn)行檢測，探究老嫩影響時(shí)3年期，1年期均在一起統(tǒng)計(jì)，探究樹齡影響時(shí)，將不同樹齡的鹽膚木葉進(jìn)行分開統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表2。

表2 12株鹽膚木樣品中化合物含量測定結(jié)果 (mg/g)

由表2可見，鹽膚木嫩葉與老葉的總酚無顯著差異(LSD檢驗(yàn)，P>0.05)；由圖5可知，鹽膚木葉共鑒定出6種化合物，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯在鹽膚木嫩葉片分別與中等嫩葉片和老葉片具有顯著差異(P<0.05)，表兒茶素沒食子酸酯在鹽膚木嫩葉片和老葉片具有顯著差異(P<0.05)，根皮苷在鹽膚木嫩葉片和老葉片，中等嫩葉片和老葉片具有顯著差異(P<0.05)，其余成分均無顯著差異(P>0.05)。此外，在本研究中，總酚在3年以上的鹽膚木樹的葉片與1年左右的樹的葉片之間不存在顯著差異(t檢驗(yàn)，P>0.05)，而沒食子乙酯、根皮苷存在顯著差異(P<0.05)，表明鹽膚木葉片總酚受樹齡影響較小，沒食子乙酯，根皮苷受樹齡影響較大，3年期以上鹽膚木葉較1年期鹽膚木葉根皮苷含量較多，而沒食子乙酯含量較少。

A：標(biāo)準(zhǔn)品；B：樣品；1：沒食子酸；2：沒食子酸甲酯；3：表沒食子兒茶素沒食子酸酯；4：沒食子酸乙酯；5：表兒茶素沒食子酸酯；6:根皮苷。

3 討論

鹽膚木葉總酚的提取工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取溶液為80%甲醇時(shí)，料液比1∶100(g/mL)提取時(shí)間為50 min時(shí)，可獲得的多酚最多；相較前人研究[17-19]，在鹽膚木酚類提取時(shí)多采用乙醇提取，筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲醇對酚類化合物的提取能力要高于乙醇，但甲醇作為溶劑的不足之處是其毒性較乙醇大；前人多采用1∶40的料液比，通常情況下料液比中的“液”越多，提取效果越好，但常需考慮試劑的成本收益率和污染等因素，并且由于測量總酚試劑有效量程基本固定，過多過少的提取液都會使溶液濃度超出試劑有效量程，如果再度稀釋或濃縮會增加試驗(yàn)操作難度，導(dǎo)致試驗(yàn)誤差增大，所以在選擇考慮料液比時(shí)應(yīng)綜合考慮各種因素。

在本研究中，所采摘的自然生長的鹽膚木葉片總酚含量均低于13%，7月和8月的含量較高；從5月中旬至7月中旬鹽膚木葉片的總酚含量不斷增加，并在7月達(dá)到峰值，之后呈下降趨勢；這表明，鹽膚木葉片的總酚含量隨著氣溫升高和光照增強(qiáng)而增加，這可能是因?yàn)閱螌幩岬确宇愇镔|(zhì)具有較強(qiáng)的吸水性和紫外光吸收能力，從而有利于提高植物的抗旱能力和抗紫外線能力[22]。從已有研究來看[23-24]，植物次生代謝物的累積多呈拋物線形，即從發(fā)芽起逐漸累積，達(dá)到一定峰值后便呈下降趨勢。然而，在本研究中，與老葉相比，幼嫩葉片在某些成分(如，表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和根皮苷)的積累上更具優(yōu)勢。而3年期對比1年期期鹽膚木所產(chǎn)葉片其根皮苷含量更高，因而更具有潛在的開發(fā)利用價(jià)值，而沒食子乙酯卻在1年期鹽膚木葉中含量更多，其原因值得進(jìn)一步研究?？傊狙芯勘砻鼷}膚木葉主要藥用成分的含量受其采集時(shí)間、樹齡、葉齡以及提取條件的影響，這可為鹽膚木葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。