侯 波，王振國(guó)，滕 川

(1.山東省淄博市第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，山東 淄博 255200；2.山東省淄博市第一醫(yī)院 腫瘤二科，山東 淄博 255200；3.武警特色醫(yī)學(xué)中心 神經(jīng)外科，天津 300162)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤，在臨床上是最難治愈的腫瘤之一[1]。除了其細(xì)胞起源多樣，神經(jīng)膠質(zhì)瘤還顯示出分子和遺傳的異質(zhì)性[2]。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)系統(tǒng)就是其中一種與膠質(zhì)瘤有關(guān)的途徑，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)[3-4]。IGF1受自身調(diào)節(jié)和重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)的調(diào)節(jié)[3]。IGFBP5的表達(dá)除受IGF1的調(diào)節(jié)，還受視黃酸(RA)、腦膜瘤蛋白1抗體(MN1)調(diào)節(jié)，與腫瘤惡性度和不良預(yù)后相關(guān)[5-6]。MN1作為一種轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，與視黃酸受體/視黃酸x受體(RAR/RXR)，激活RA介導(dǎo)的IGFBP5表達(dá)[7-8]。還已知MN1的缺失與患者神經(jīng)發(fā)育異常有關(guān)[9]。上述研究證實(shí)了MN1和IGFBP5兩個(gè)基因表達(dá)的水平相關(guān)，因此，本研究推測(cè)可以通過(guò)MN1預(yù)測(cè)人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存率。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 腫瘤標(biāo)本來(lái)源于2015年7月至2018年7月淄博市第一醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)切除的87例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者。87例患者中，男42例(48.3%)，女45例(51.7%)；年齡為(38.5±6.8)歲(19～65歲)；腫瘤最大徑為(4.7±2.1)cm(2.3～6.5 cm)。隨訪時(shí)間為(43±14)個(gè)月(27～63個(gè)月)。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)行的進(jìn)一步分級(jí)[5]，將I級(jí)和II級(jí)腫瘤分類為低度惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(LG)29例，將III級(jí)和IV級(jí)的腫瘤分類為高度惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(HG)58例。商業(yè)購(gòu)買正常非腫瘤性大腦MN1與IGF-1、IGFBP5 mRNA和蛋白用于正常對(duì)照。本研究獲得淄博市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：201506003)，所有患者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

表1 膠質(zhì)瘤病例的臨床資料

1.2 試劑和材料 RNA提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技(北京)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)sigma公司。IGFBP5、IGF1、MN1和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 按照使用說(shuō)明，使用TRIZOL試劑從小鼠腦組織中收獲總mRNA，按照表1中列出了靶基因特異性引物的序列，使用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，SYBR Green實(shí)時(shí)PCR預(yù)混試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶qPCR分析，StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)定量PCR，實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)分析以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析。

表2 實(shí)時(shí)PCR中使用的引物序列

1.4 Western blot 將腫瘤組織破碎后使用RIPA緩沖液從腦組織中收集蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白總濃度，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，電泳后，半干轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。使用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，然后在4°C下分別與一抗(IGFBP5、IGF1、MN1和GAPDH)孵育過(guò)夜。用TBST洗滌后將膜與山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL試劑盒)檢測(cè)免疫反應(yīng)性條帶，并使用ImageJ 1.42q軟件程序分析圖像。

2 結(jié)果

2.1MN1在LG組表達(dá)水平高于HG組 如圖1所示，LG組MN1 mRNA 與蛋白表達(dá)水平高于sham組，而HG組MN1 mRNA 與蛋白表達(dá)水平低于sham組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HG組與LG組相比，MN1 mRNA 與蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

A：MN1mRNA表達(dá)水平；B：MN1蛋白表達(dá)Western blot條帶；C：MN1蛋白表達(dá)水平量化。*:與sham組相比，P <0.05，#：與LG組相比，P <0.05。

2.2MN1表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級(jí)相關(guān)性比較MN1mRNA表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級(jí)負(fù)相關(guān)(r=-0.763，P=0.000)，按照WHO分級(jí)分組，4個(gè)分組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2，表1)。

表1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤各分組MN1mRNA表達(dá)比較

圖2 MN1mRNA表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)性

2.3MN1表達(dá)水平與總生存期的影響 LG組分為低表達(dá)量MN1亞組(LGL組)和高表達(dá)量MN1亞組(LGH組)，LGL組生存率低于LGH組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.162，見(jiàn)圖3A)；HG組分為低表達(dá)量MN1亞組(HGL組)和高表達(dá)量MN1亞組(HGH組)，HGL組生存率顯著低于HGH組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022,見(jiàn)圖3B)。

A：低度惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組(LG組，29例)中低表達(dá)量MN1亞組(LGL組，14例)和高表達(dá)量MN1亞組(LGH組，15例)生存曲線比較；B：高度惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組(HG組，58例)中低表達(dá)量MN1亞組(HGL組，29例)和高表達(dá)量MN1亞組(HGH組，29例)生存曲線比較。

2.4IGF1、IGFBP5 mRNA 與蛋白表達(dá)水平 與sham組相比，LG組和HG組IGF1mRNA與蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HG組與LG組相比，IGF1 mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與sham組相比，LG組和HG組IGFBP5mRNA與蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HG組與LG組相比，IGFBP5 mRNA 與蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

A：IGF1mRNA表達(dá)水平；B：IGFBP5mRNA表達(dá)水平；C：IGF1、IGFBP5蛋白表達(dá)Western blot條帶；D：IGF1蛋白表達(dá)水平量化；E：IGFBP5蛋白表達(dá)水平量化；*：與sham組相比，P<0.05，#：與LG組相比，P<0.05。

2.5MN1與IGF1、IGFBP5相關(guān)性 在LG組、HG組和所有患者組中MN1mRNA值與IGF1和IGFBP5mRNA值均呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 MN1與IGF1、IGFBP5相關(guān)性

3 討論

研究顯示MN1的共調(diào)節(jié)基因位于22號(hào)染色體上，該基因在人腦腫瘤中突變[10]。然而，人腦膠質(zhì)瘤中MN1的改變尚未得到系統(tǒng)的評(píng)估。本研究發(fā)現(xiàn)MN1表達(dá)量增加預(yù)示著神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者更好的生存率。此外，MN1、IGF1和IGFBP5的共同分子作用可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的重要因素，在預(yù)測(cè)患者預(yù)后方面具有臨床意義。

本研究觀察到MN1表達(dá)與腫瘤分級(jí)負(fù)相關(guān)，且在HG組MN1過(guò)表達(dá)預(yù)示著更好的臨床預(yù)后。Chen等曾報(bào)道神經(jīng)膠質(zhì)瘤低度惡性組中的MN1表達(dá)增加。生存分析測(cè)試結(jié)果中，在LG組和HG組MN1表達(dá)上調(diào)的患者顯示出生存優(yōu)勢(shì)。MN1具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的特性，但缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此起著協(xié)同調(diào)節(jié)子的作用[10-11]。研究表明，MN1與RAR/RXR之間的合作對(duì)于RA介導(dǎo)的IGFBP5轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要[8]，還已知IGF1調(diào)節(jié)IGFBP5[12]。在本研究中發(fā)現(xiàn)HG組IGF1、IGFBP5的表達(dá)較高，而MN1表達(dá)在LG組和HG組中與IGFBP5負(fù)相關(guān)，因此，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，IGFBP5可能同時(shí)受到MN1和IGF1的調(diào)節(jié)。這也表明MN1傾向于抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤中IGFBP5的表達(dá)。但是，IGF1可能與MN1介導(dǎo)的阻遏作用相反，增強(qiáng)IGFBP5的表達(dá)。抑制和激活調(diào)節(jié)力之間的這種分子相互作用共同決定了IGFBP5表達(dá)。這些研究結(jié)果有助于對(duì)評(píng)估臨床預(yù)后。

在HG組中，較低的MN1水平可能導(dǎo)致較小的抑制，由于IGF1介導(dǎo)的表達(dá)誘導(dǎo)而導(dǎo)致IGFBP5積累。類似于以前的報(bào)告，發(fā)現(xiàn)LGG和HGG中的IGFBP5過(guò)表達(dá)預(yù)示了不良的中位生存期[13]。因此，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中IGBP5的水平似乎可以通過(guò)MN1和IGF1的相反作用以腫瘤分級(jí)特異性的方式進(jìn)行微調(diào)，從而可以預(yù)測(cè)患者的生存率。

本研究首次得出，MN1表達(dá)量與膠質(zhì)瘤預(yù)后生存相關(guān)，與IGFBP5表達(dá)成反比?；谇拔姆治觯狙芯刻岢鯩N1、IGF1和IGFBP5的相互調(diào)節(jié)作用，決定了不同神經(jīng)膠質(zhì)瘤等級(jí)及臨床進(jìn)程和特征。未來(lái)課題組研究將從神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理學(xué)的意義。