畢 麗,杜 帥,于丹婷,張麗梅,賀紀(jì)正,韓麗麗,*

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100085

2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

3 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院, 福州 350007

病毒是地球上數(shù)量最多、種類最豐富的生物實(shí)體,也是生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈和食物網(wǎng)的重要組成部分。環(huán)境病毒生態(tài)學(xué)早期主要在海洋生態(tài)系統(tǒng)中開(kāi)展研究,而陸地生態(tài)系統(tǒng)病毒學(xué)研究在近10年才逐漸發(fā)展。據(jù)報(bào)道每克土壤中的病毒顆粒高達(dá)107—109個(gè)[1],比細(xì)菌總數(shù)高1—2個(gè)數(shù)量級(jí)[2]。病毒在陸地生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能[3-4],如影響宿主的死亡率和群落結(jié)構(gòu)。Li等通過(guò)T4型噬菌體標(biāo)記基因(g23)和細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)T4型噬菌體能夠影響水稻土壤細(xì)菌群落組成[5]。同時(shí),土壤病毒可能是影響微生物死亡率和周轉(zhuǎn)速率的主要原因之一,它可裂解細(xì)胞釋放出大量的可溶性和顆粒態(tài)有機(jī)碳,促進(jìn)其他微生物的轉(zhuǎn)化和利用,從而影響微生物群落結(jié)構(gòu)和元素的生物地球化學(xué)循環(huán)[6-7]。此外,病毒還可通過(guò)攜帶輔助代謝基因(auxiliary metabolic genes,AMGs)影響宿主代謝,從而間接參與元素循環(huán)[4, 8],同時(shí)也為宿主提供新的功能基因以拓寬其生態(tài)位[8]。

由于土壤病毒具有龐大的數(shù)量體和潛在的生態(tài)功能,越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始關(guān)注土壤病毒。土壤病毒豐度和多樣性的研究方法主要包括熒光顯微計(jì)數(shù)法、透射電子顯微觀察、分離培養(yǎng)、特定標(biāo)記基因分析、宏基因組學(xué)和宏病毒組學(xué)等[9-10]。宏病毒組和宏基因組是目前病毒生態(tài)學(xué)研究最重要的手段[3, 10],可以成功避免大量病毒不可培養(yǎng)和缺乏通用標(biāo)記基因所帶來(lái)的問(wèn)題,尤其是宏病毒組學(xué)可極大地增加測(cè)序序列中病毒基因組的覆蓋度。宏病毒組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在納米布沙漠土壤中,有尾噬菌體目(Caudovirales)豐度最高,其中以長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)為主[11],這與南極土壤中主要病毒類群的分布一致[12]。而在中國(guó)的農(nóng)田土壤中主要以單鏈DNA(ssDNA)病毒為主導(dǎo),其中以微小噬菌體科(Microviridae)和環(huán)狀病毒科(Circoviridae)為主[13]。近期,Starr等首次通過(guò)宏轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),植物根際與非根際土壤中的RNA病毒多樣性很高,凋落物顯著影響病毒和宿主的群落組成,而根系的生長(zhǎng)不影響RNA病毒的群落組成[14]。

目前我國(guó)土壤宏病毒組僅有少量的研究,主要關(guān)注了農(nóng)田[13, 15]、紅樹(shù)林[16],冰川[17]以及海陸交錯(cuò)帶土壤[18]。不同土地利用方式會(huì)影響土壤理化性質(zhì),例如土壤pH和養(yǎng)分[19],以及微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[20]。但是我們對(duì)于不同土地利用方式下,病毒的群落結(jié)構(gòu)和功能特征還缺乏認(rèn)識(shí)。因此本研究從新疆阿克蘇沙雅縣選取兩種典型土地利用方式下的土壤(棉花地和荒漠土壤),通過(guò)宏病毒組學(xué)技術(shù)探究土壤病毒群落結(jié)構(gòu)和功能特征,為進(jìn)一步了解農(nóng)業(yè)活動(dòng)對(duì)土壤病毒分布的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣品采集

采樣點(diǎn)位于新疆阿克蘇沙雅縣(東經(jīng)82.54°、北緯41.32°),該地區(qū)屬于暖溫帶沙漠邊緣氣候區(qū)。本研究于2018年6月采集該地區(qū)棉花地土壤和荒漠土壤。棉花地種植時(shí)間約10a,與荒漠土壤之間間隔約200 m。使用梅花布點(diǎn)法(間隔大于3 m)布設(shè)采樣點(diǎn),每個(gè)土壤樣品選取6個(gè)樣點(diǎn),在每個(gè)樣點(diǎn)采集0—10 cm土壤樣品。土壤樣品通過(guò)冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。所有土壤通過(guò)2 mm篩去除植物殘?bào)w后,儲(chǔ)存于4℃冰箱用于后期土壤理化性質(zhì)測(cè)定和病毒提取。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

1.3 土壤病毒DNA提取及測(cè)序

分別將棉花地和荒漠土壤6個(gè)樣點(diǎn)的土壤混合成一個(gè)樣品,根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)方法提取鮮土中的病毒[13],每個(gè)樣品提取1次。簡(jiǎn)述如下：稱取過(guò)2 mm篩的鮮土500 g,與3 L的甘氨酸緩沖液(250 mM,pH=8.5)混合均勻,于150 rpm振蕩15 min?；旌弦河?℃ 1500 rpm條件下低速離心2 min。收集上清液,沉淀繼續(xù)添加緩沖液,重懸浮,混合均勻,并重復(fù)以上步驟兩次。利用切向流過(guò)濾系統(tǒng)(Tangential Flow Filter System, QuixStand, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)對(duì)上清液進(jìn)行連續(xù)過(guò)濾,依次通過(guò)1 mm,0.45 μm和0.22 μm的濾柱,并收集透過(guò)液。再將透過(guò)液通過(guò)30 kDa的超濾柱進(jìn)行濃縮并收集截留液(體積不大于100 mL)。濃縮液再經(jīng)過(guò)0.22 μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾,重復(fù)3次以去除連續(xù)過(guò)濾過(guò)程中可能帶來(lái)的雜菌污染。再以4000 g的轉(zhuǎn)速通過(guò)30 kDa超濾離心管(Merck Millipore Ltd., Tullagreen, Ireland)進(jìn)一步濃縮至體積約為1 mL。接著將病毒濃縮液用DNase I(Thermo Fisher Scientific, Lithuania, EU)在37℃孵育1 h(10 units DNase I/500 μL),以去除土壤中游離的胞外DNA。利用細(xì)菌16S rRNA基因PCR(引物27F/1492R)[21]檢測(cè)并確認(rèn)沒(méi)有細(xì)菌DNA污染后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

使用病毒DNA提取試劑盒(Qiagen AllPrep PowerViral DNA/RNA extraction kit(Qiagen, Hilden, Germany))提取濃縮液中的病毒DNA。隨后根據(jù)基因組擴(kuò)增試劑盒(REPLI-g Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany))使用說(shuō)明對(duì)提取的病毒DNA進(jìn)行多重置換擴(kuò)增,以得到足量的病毒DNA來(lái)構(gòu)建宏病毒組文庫(kù)。分別利用Nanodrop和Qubit檢測(cè)DNA的純度和濃度。再利用超聲破碎儀Covaris M220(Covaris, Woburn, MA, USA)將DNA隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約為350 bp的片段,建立宏病毒組文庫(kù)后進(jìn)行Ilumina HiSeq2500高通量測(cè)序。測(cè)序工作由北京新科開(kāi)源基因科技有限公司完成。

1.4 宏病毒組數(shù)據(jù)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)通過(guò)fastp軟件,選擇默認(rèn)參數(shù)[22]過(guò)濾接頭并去除低質(zhì)量序列,最后得到clean reads。利用SortMeRNA v2.1去除clean reads中的核糖體序列[23],利用bbmap比對(duì)NCBI UniVec數(shù)據(jù)庫(kù)(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/UniVec, March 2017)去除可移動(dòng)遺傳元件。然后利用metaSPAdes[24]對(duì)clean reads進(jìn)行組裝拼接得到原始contigs。Clean reads與病毒數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTx比對(duì)和物種注釋(E-Value<1e-5,score值> 50)[25],病毒數(shù)據(jù)庫(kù)綜合了NCBI non-redundant(NR)數(shù)據(jù)庫(kù),Refseq virus 數(shù)據(jù)庫(kù)和PHAST網(wǎng)站上的噬菌體數(shù)據(jù)庫(kù)(截至2018年8月)[26-28]。比對(duì)得到的病毒序列使用Prodigal以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(ORFs)預(yù)測(cè)[29],并與NR和RefSeq病毒蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(Diamond,BLASTp,E-Value<1e-5,identity>60%)[25],最后在MEGAN 6中利用SEED數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)病毒進(jìn)行功能分類[30]。通過(guò)Virsorter預(yù)測(cè)病毒contigs[31],contigs僅選取于具有更高可信度的categories 1,2,5。病毒基因組示意圖通過(guò)Easyfig進(jìn)行可視化[32]。

1.5 序列提交

本研究中的兩個(gè)宏病毒組原始序列已經(jīng)提交至NCBI Sequence Read Archive(SRA),獲取號(hào)為PRJNA599555。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

表1 土壤理化性質(zhì)

2.2 土壤病毒組信息

通過(guò)宏病毒組測(cè)序,從新疆棉花地和荒漠土壤樣品中分別獲得78072330和80219056條clean reads,GC含量分別為53.56%和49.45%。在棉花地和荒漠土壤宏病毒組中分別有12.34%和11.57%的reads比對(duì)上病毒數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)clean reads進(jìn)行拼接,在棉花地和荒漠土壤宏病毒組中分別獲得3050和2771條contigs(>1000 bp),最長(zhǎng)的兩條contigs分別為13586 bp和17062 bp(表2)。

表2 病毒組信息

2.3 病毒群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)病毒數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,新疆棉花地和荒漠土壤宏病毒組分別注釋到20個(gè)和15個(gè)病毒科和一些未分類的病毒(圖1)。在兩種土壤中,均是ssDNA病毒占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),其中微小噬菌體科占比最高,分別為69%和78%。微小噬菌體科主要包括蘑菇狀噬菌體亞科(Gokushovirinae),分別占據(jù)棉花地和荒漠土壤宏病毒組的35%和39%。環(huán)狀病毒科在棉花地和荒漠土壤中所占比例分別為2.0%和0.7%,矮縮病毒科(Nanoviridae)在兩種土壤中所占比例分別為0.4%和0.2%。兩種土壤中均檢測(cè)到Genomoviridae、雙生病毒科(Geminiviridae)、短尾噬菌體科(Podoviridae)、肌尾噬菌體科(Myoviridae)、長(zhǎng)尾噬菌體科、Alphasatellitidae、Smacoviridae和脫氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)等。此外在棉花地土壤中特有的病毒有花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)、裸露病毒科(Nudiviridae)、多分DNA病毒科(Polydnaviridae)、桿狀病毒科(Baculoviridae)和囊泡病毒科(Ascoviridae)。而乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)僅在荒漠土壤病毒組中檢測(cè)到。

圖1 兩個(gè)土壤病毒組物種注釋結(jié)果(基于reads注釋)

2.4 病毒功能特征

利用MEGAN的SEED數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩種土壤的病毒功能進(jìn)行分類,Level 1水平的主要病毒功能占比類似,均是“Phages, Prophages, Transposable elements”和“Phages, Prophages, Transposable elements, Plasmids”占比最高(圖2)。在棉花地土壤中注釋到更多的病毒功能分類單元,除以上兩種功能外還注釋到“Amino Acids and Derivatives”、“Carbohydrates”、“Cofactors, Vitamins, Prosthetic Groups, Pigments”和“Photosynthesis”。在level 2水平上,兩個(gè)土壤一共注釋到30個(gè)病毒功能分類單元,其中“Phage capsid proteins”所占比例最高,其次是“Phage packaging machinery”和“Phage head and packaging”(圖2)。

圖2 病毒功能注釋

2.5 病毒基因組分析

通過(guò)Virsorter預(yù)測(cè)病毒序列和功能注釋,在棉花田土壤病毒組中注釋到711條病毒contigs(> 1 kb),在荒漠土壤病毒組中注釋到1113條病毒contigs(> 1 kb)。兩個(gè)土壤中的病毒contigs均主要注釋到微小噬菌體科。大于5 kb的contigs一共有147條,選擇其中最長(zhǎng)的兩條contigs分析其功能基因組成(圖3)。Contig 1攜帶14個(gè)基因,其中包括8個(gè)病毒相關(guān)功能基因(protein affiliated to virus),5個(gè)未知功能基因(unknown function)和1個(gè)假設(shè)蛋白(hypothetical protein)。Contig 2攜帶18個(gè)基因,其中包括9個(gè)病毒相關(guān)功能基因,1個(gè)未知功能基因和8個(gè)假設(shè)蛋白(圖3)。

圖3 基因組示意圖

3 討論

3.1 新疆兩種土地利用方式下土壤病毒群落組成

土壤微生物在自然和人工生態(tài)系統(tǒng)中都扮演著十分重要的角色。標(biāo)記基因和宏基因組學(xué)等研究方法極大地推動(dòng)了我們對(duì)土壤微生物的認(rèn)知和應(yīng)用,例如合理利用微生物來(lái)提高土壤肥力、增加作物產(chǎn)量,增強(qiáng)了我們對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)響應(yīng)環(huán)境變化的理解[33]。病毒也在陸地生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,例如通過(guò)侵染微生物來(lái)調(diào)控宿主代謝、影響宿主死亡率等[34]。加州大學(xué)戴維斯分校Joanne B.Emerson副教授提出土壤病毒學(xué)是土壤微生物學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn),并指出未來(lái)可以探究土壤病毒對(duì)有機(jī)質(zhì)降解、碳氮元素循環(huán)、溫室氣體排放以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響[35],從而補(bǔ)充土壤微生物對(duì)生態(tài)過(guò)程的貢獻(xiàn)。

本研究通過(guò)宏病毒組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),新疆兩種不同土地利用方式下的土壤均富集到大量的ssDNA病毒,其中以微小噬菌體科為主。ssDNA病毒一般包括絲狀病毒科(Inoviridae)和微小噬菌體科兩個(gè)噬菌體病毒科和五個(gè)真核病毒科[36]。微小噬菌體科是具有環(huán)狀單鏈DNA基因組的二十面體的噬菌體家族,主要侵染腸桿菌、細(xì)胞內(nèi)寄生菌和螺原體[37]。微小噬菌體科在感染周期中的潛伏期短、子代釋放量大[38],從而廣泛分布于環(huán)境中,如海洋、污水、沉積物和人體腸道等均有分布。2015年Brian Reavy等人通過(guò)宏病毒組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),蘇格蘭濱海土壤和農(nóng)田土壤中ssDNA病毒數(shù)量占比最大,以微小噬菌體科為主(分別占84.6%和50.32%)[39]。而在紅樹(shù)林土壤中以動(dòng)物病毒環(huán)狀病毒科占主導(dǎo),其次是微小噬菌體科[16]。有研究指出多重置換擴(kuò)增可能會(huì)偏好性地放大ssDNA病毒[40],從而導(dǎo)致結(jié)果中ssDNA病毒比例偏高。在棉花地和荒漠土壤中,dsDNA病毒有尾噬菌體目(包括長(zhǎng)尾噬菌體科、肌尾噬菌體科和短尾噬菌體科)所占比例比較低。有尾噬菌體目在部分土壤樣品中也占據(jù)主導(dǎo)地位,例如納米布沙漠土壤[11]、美國(guó)某些農(nóng)田土壤[41]以及我國(guó)新疆冰川土壤[17]。

3.2 土壤病毒功能特性

棉花地和荒漠土壤宏病毒組的主要病毒功能注釋結(jié)果相似,均主要注釋到與病毒結(jié)構(gòu)相關(guān)的功能,其中“Phage capsid proteins”和“Phage packaging machinery”占比最高(圖2)。兩條全長(zhǎng)病毒基因組序列的分析也表明可注釋的編碼基因均以病毒結(jié)構(gòu)相關(guān)功能為主,未知功能蛋白仍占較高比例(圖3)?！皃hage capsid proteins”是病毒相關(guān)的衣殼蛋白,可作為某些特定病毒類群的標(biāo)記基因,例如T4噬菌體的g23基因[44-45]和微小噬菌體科的VP1蛋白[46]。在納米布沙漠土壤病毒功能中,“phages, prophages, transposable elements, plasmids”占比最高(49%)[11]。這也與一些美國(guó)農(nóng)田土壤病毒的主要功能類似[41],而部分病毒功能分類單元在農(nóng)田表層和深層土壤中的相對(duì)豐度差異較大,在深層土壤中檢測(cè)到更多的噬菌體結(jié)構(gòu)相關(guān)功能(如噬菌體衣殼、尾部和頸部纖維)。但在中國(guó)南方紅壤中,僅有少部分病毒功能在玉米根際與非根際土壤之間存在顯著差異[15]。此外,相對(duì)于其他土壤,棉花地和荒漠土壤病毒組功能類群較為單一[2, 41]。這也可能受到土樣樣品數(shù)量的限制,對(duì)于不同土地利用方式下土壤病毒功能特征與差異還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣品進(jìn)行探索。此外,由于目前我們對(duì)病毒功能基因的分析主要依賴現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù),而相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)還不完善,功能注釋仍存在局限性,因此土壤病毒功能特征還有待進(jìn)一步地探索和挖掘。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)宏病毒學(xué)方法分析了新疆兩種土地利用方式下土壤病毒的群落組成和功能特征。棉花地和荒漠土壤的理化性質(zhì)存在顯著差異,兩種土壤分別注釋到20個(gè)和15個(gè)病毒科,均以ssDNA病毒為優(yōu)勢(shì)類群,其中以微小噬菌體科占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在棉花地土壤中檢測(cè)到更高比例的植物病毒(矮縮病毒科和雙生病毒科)。此外,僅在棉花地土壤中檢測(cè)到與植物相關(guān)的花椰菜花葉病毒科,與昆蟲(chóng)相關(guān)的裸露病毒科、多分DNA病毒科、桿狀病毒科和囊泡病毒科。這些結(jié)果表明土壤病毒群落組成可能受到與土地利用方式相關(guān)的人為活動(dòng)、土壤理化性質(zhì)和動(dòng)植物的影響。在兩種土壤中共獲得1824條病毒contigs,主要匹配到微小噬菌體科。用SEED數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)病毒功能進(jìn)行注釋,棉花地和荒漠土壤病毒組的功能注釋均以病毒結(jié)構(gòu)相關(guān)功能基因占比最高。本研究探索了新疆農(nóng)田土壤和荒漠土壤病毒組的特征,未來(lái)研究人員還需要在更大時(shí)空尺度和基于更多樣品的土地利用方式上探究土壤病毒生態(tài)學(xué),并進(jìn)一步闡明土壤病毒對(duì)陸地生態(tài)過(guò)程的貢獻(xiàn)。