陶文婷，陳姣姣，高清華，翟 毅，李蔚華△

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065； 2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢 430077)

遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity, DTH)是公共健康面臨的重要挑戰(zhàn)之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有15%～20%的人患有此種疾病[1]。DTH發(fā)生較慢，通常在接觸相同抗原24～72 h后出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[2]，是一種由特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其主要效應(yīng)細(xì)胞是CD4+Th1細(xì)胞[3]，臨床特征主要為單核細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷。

小檗堿是從傳統(tǒng)中藥黃連和黃柏中提取出來(lái)的異喹啉類(lèi)生物堿[4]，具有多種藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、降血糖、調(diào)血脂、保護(hù)新血管以及免疫抑制等[5-7]。在動(dòng)脈粥樣硬化中，小檗堿能夠抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路，阻礙NF-kappa-B inhibitor alpha(IkB-α)磷酸化和p65蛋白核轉(zhuǎn)位，發(fā)揮抗炎作用[8]；在潰瘍性結(jié)腸炎中，小檗堿活化信號(hào)傳導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducing activator of transcription，STAT)1和STAT3降低Th17和Th1細(xì)胞分化，抑制白介素-17(interleukin-17，IL-17)及γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)分泌發(fā)揮抗炎作用[9-10]。有研究表明，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，小檗堿可通過(guò)下調(diào)p-ERK、p-P38和p-JNK表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，改善關(guān)節(jié)組織破壞情況[11]。同時(shí)小檗堿具有免疫毒性，在DTH中發(fā)揮免疫抑制作用，但其具體機(jī)制不明[12]。本研究使用小檗堿作用于遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠，觀察其抗炎效應(yīng)并探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)32只雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001。在室溫(20 ± 2)℃，12 h光照，自由飲食環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(倫理學(xué)批號(hào)HUCMS2018101102)。

1.2 藥品與試劑

小檗堿(貨號(hào)B3251)、12.5%EDTA(貨號(hào)D2900000)、卵清蛋白(ovalbumin, OVA，貨號(hào)O1641)、弗氏完全佐劑(貨號(hào)F5881)、刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A，貨號(hào)L7647)等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào)21870100)、胎牛血清(貨號(hào)10099133C)、抗生素(5000 μ/mL鏈霉素和青霉素，貨號(hào)15070063，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(貨號(hào)7200100)，購(gòu)自中國(guó)達(dá)科為公司；γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ，貨號(hào)25712)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α，貨號(hào)24835)和白介素-4(interleukin-4，IL-4)(貨號(hào)287287)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒，購(gòu)自中國(guó)欣博盛公司。

1.3 主要儀器

冰凍切片機(jī)(CM1860UV，德國(guó)Leica公司)；倒置顯微鏡(BX40F4，日本尼康公司)；離心機(jī)(FC5515R，美國(guó)OHAUS)；CO2培養(yǎng)箱(MCO-18 A型，日本松下公司)；酶標(biāo)分析儀(DNM-9602，北京普朗新技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 造模與分組

動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、DTH組、小檗堿組、DTH+小檗堿組4組各8只，隨機(jī)編號(hào)稱(chēng)重。DTH組在第1天皮下注射致敏劑(將50μg OVA 溶于50 μL生理鹽水中，然后用50 μL完全弗氏佐劑乳化)，第8天于左足墊注射激發(fā)劑(將200μg 熱聚OVA溶解于20 μL的PBS中)，右足墊注射等體積的PBS作為對(duì)照，24 h后頸椎脫臼處死取材。小檗堿組第2天至第8天腹腔注射小檗堿(10 mg/(kg·d)溶于0.05%DMSO(圖1)，對(duì)照組僅腹腔注射等量0.05%DMSO。

圖1 造模示意圖

2.2 觀察指標(biāo)與方法

2.2.1 小鼠足墊厚度測(cè)量 游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠雙后肢足墊厚度，足墊腫脹程度=OVA注射側(cè)足墊厚度-PBS注射側(cè)足墊厚度。

2.2.2 HE染色 分離足墊組織，常規(guī)制片，用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)進(jìn)行染色，鏡下觀察并進(jìn)行炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)。隨機(jī)選取5個(gè)視野(×400)，對(duì)視野中的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后取平均值。

2.2.3 ELISA檢測(cè) 將足墊進(jìn)行組織勻漿，離心后取上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)IFN-γ、 TNF-α和IL-4水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.4 脾臟單個(gè)核細(xì)胞制備 取脾臟組織置于培養(yǎng)皿中，加入淋巴細(xì)胞分離液分離脾臟組織，將樣本轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，并覆蓋500 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，室溫下800 g離心30 min，吸取第2層環(huán)狀乳白色液體(淋巴細(xì)胞層)于另1個(gè)干凈離心管中，加入5 ml紅細(xì)胞裂解液，4 ℃靜置5 min后加入PBS 5 ml，350 g離心5 min，洗滌1～2次，最后沉積于試管底部的即為淋巴細(xì)胞。加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及100 U/mL鏈霉素和青霉素)重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，次日取未貼壁細(xì)胞為脾臟單個(gè)核細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度1×106個(gè)/mL。

2.2.5 ConA刺激實(shí)驗(yàn) 將2 mg Con A溶于100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后用培養(yǎng)基稀釋至5μg/mL。取不同組的脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液100 μL到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再分別加入100 μL ConA稀釋液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，收集上清，ELISA法檢測(cè)IFN-γ水平。

2.2.6 OVA致敏檢測(cè) 從DTH組小鼠獲得的脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液接種至 96孔培養(yǎng)板中，2×106/孔，設(shè)置空白對(duì)照組、OVA組和0.1、1、10 μM濃度的小檗堿組。將培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育72 h，收集上清，用ELISA檢測(cè)IFN-γ、IL-4水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小檗堿抑制OVA誘導(dǎo)DTH

表1、2示，DTH模型小鼠足墊腫脹明顯，低[0.1 mg/(kg·d)]、中[1 mg/(kg·d)]劑量小檗堿處理無(wú)明顯影響。當(dāng)小檗堿濃度為10 mg/(kg·d)時(shí)，足墊腫脹程度明顯減輕(P<0.001)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用小檗堿濃度為10 mg/(kg·d)。用OVA誘導(dǎo)DTH，DTH組的足墊明顯腫脹(P<0.001)與之比較，DTH+小檗堿組腫脹程度明顯減輕(P<0.001)。

表1 不同劑量小檗堿對(duì)DTH小鼠足墊腫脹的影響

表2 各組足墊組織增長(zhǎng)的厚度比較

3.2 小檗堿減少DTH小鼠足墊組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

表3示，HE染色與DTH組比較，DTH+小檗堿組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目顯著減少(P<0.001)，提示小檗堿可抑制足墊組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，改善小鼠足墊炎癥情況。

表3 各足墊組織炎性細(xì)胞數(shù)目比較(個(gè)

3.3 小檗堿減輕DTH炎癥因子釋放

表4示，ELISA檢測(cè)顯示，與DTH組比較DTH+小檗堿組足墊組織中的IFN-γ、TNF-α水平明顯減少(P<0.001)，而兩者IL-4水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 足墊組織炎性因子水平比較

3.4 小檗堿抑制Th1反應(yīng)

表4示，分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞并體外培養(yǎng)，給予ConA刺激，DTH組IFN-γ分泌明顯增加。與DTH比較，DTH+小檗堿組分泌的IFN-γ明顯減少(P<0.01)，結(jié)果提示小檗堿處理能夠抑制Th1反應(yīng)，其效應(yīng)與抗炎作用相關(guān)。

表5 ConA檢測(cè)各組脾臟單個(gè)核細(xì)胞中IFN-γ水平比較

3.5 小檗堿恢復(fù)IFN-γ/IL-4平衡

表6示，OVA致敏實(shí)驗(yàn)顯示，小檗堿處理抑制IFN-γ分泌，其效應(yīng)與濃度正相關(guān)，但對(duì)IL-4無(wú)明顯影響，最終使IFN-γ/IL-4比例明顯下降并恢復(fù)平衡。

表6 小檗堿對(duì)脾臟單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ和IL-4的影響比較

4 討論

本實(shí)驗(yàn)使用OVA誘導(dǎo)的DTH模型，其致敏過(guò)程在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)就能完成，廣泛應(yīng)用于藥物免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用的研究[13]。該模型的建立分為2個(gè)階段：在致敏階段，OVA誘導(dǎo)區(qū)域淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞的活化和增殖；在效應(yīng)階段，OVA再刺激引發(fā)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集至攻擊部位，產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)并增強(qiáng)DTH的炎癥反應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較DTH組足墊厚度明顯增加，炎性細(xì)胞數(shù)目增多，且炎癥因子表達(dá)顯著增加；脾臟單個(gè)核細(xì)胞中IFN-γ分泌增多，DTH組發(fā)生Th1極化，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

根據(jù)細(xì)胞因子環(huán)境的不同，可以使Th0細(xì)胞向Th1、Th2轉(zhuǎn)化或Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間發(fā)生轉(zhuǎn)化[15]。Th1細(xì)胞主要分泌促炎性細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-1β，而Th2細(xì)胞則主要分泌抗炎性細(xì)胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-6和IL-13[16]。其中IL-4對(duì)Th0細(xì)胞分化為T(mén)h1和Th2起關(guān)鍵性調(diào)控作用。IL-4在高水平時(shí)Th0細(xì)胞主要分化為T(mén)h2細(xì)胞， IL-4缺乏時(shí)IFN-γ能夠促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞。此外，Th1分泌的IFN-γ和Th2分泌的IL-4，不僅可以促進(jìn)自身分泌細(xì)胞的成熟，還可以抑制對(duì)方的分化[15]。當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，Th1/Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，故IFN-γ/IL-4平衡一定程度上能夠反映Th1/Th2平衡狀態(tài)。在本研究中DTH組發(fā)生了Th1極化，炎性細(xì)胞因子分泌增加，小檗堿處理則抑制Th1反應(yīng)，表現(xiàn)為足墊組織炎性因子IFN-γ、TNF-α減少，脾臟單個(gè)核細(xì)胞ConA刺激實(shí)驗(yàn)IFN-γ分泌降低，小檗堿能夠降低OVA刺激脾臟單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ的分泌水平，而對(duì)IL-4無(wú)明顯影響。

總而言之，小檗堿在OVA誘導(dǎo)的DTH模型中發(fā)揮抗炎作用，其可能的作用機(jī)制是小檗堿抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，使 Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)平衡恢復(fù)，從而減緩DTH炎癥反應(yīng)。然而是否存在其他相關(guān)反應(yīng)及作用機(jī)制，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。