萬(wàn) 超，譚華儒，燕 軍，蔡 凌，黃金良，任英杰，李二梅，趙 美

(1. 深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 深圳 518104； 2. 深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院， 廣東 深圳 518101)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變或被破壞的膝關(guān)節(jié)病，主要病理變化包括軟骨下骨板及關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生、局部炎癥等[1]。軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞成分，其凋亡情況影響著關(guān)節(jié)軟骨的維持及更新[2-3]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(b-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族成員在調(diào)控線粒體凋亡通路方面發(fā)揮著重要作用。Bcl-2-Associated X(Bax)為促凋亡基因，而B(niǎo)cl-2可抑制凋亡[4-5]。如何有效延緩軟骨細(xì)胞凋亡可能是緩解KOA進(jìn)展的關(guān)鍵所在。內(nèi)熱針起源于古代針灸技術(shù)中“九針”的一種，在治療上較常規(guī)針灸具有一定優(yōu)勢(shì)[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)熱針療法對(duì)KOA大鼠具有一定的治療效果[7]，但內(nèi)熱針有效性機(jī)制研究開(kāi)展尚少。本研究通過(guò)觀察內(nèi)熱針對(duì)KOA模型大鼠的治療效果，探究Bcl-2/Bax平衡與其治療作用的聯(lián)系，以期為KOA的臨床治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1 主要試劑 大鼠白介素-1β，interleukin-1β，IL-1β(No. RA20030)，Bioswamp公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(No. RA20035)和白介素-17(interleukin-17，IL-17)(No. RA20117)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒；RNA提取試劑盒(貨號(hào)9767)，TAKARA公司；兔抗大鼠Bcl-2抗體(No. ab59348，稀釋比1∶500)、兔抗大鼠Bax抗體(No. ab32503，稀釋比1∶1000)，英國(guó)Abcam公司；TUNEL Apoptpsis Assay Kit(No. PAB180028)，Bioswamp公司。

1.1.2 主要儀器 JK-Ⅰ內(nèi)熱針(濟(jì)寧佳科公司，型號(hào)0.5 mm)針體長(zhǎng)6.5 cm，直徑0.5 mm，針柄長(zhǎng)3.5 cm，直徑2.2 mm；RS15 A，中頻脈沖電治療儀(廣州睿盛公司)；Real-Time System熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD)；ELX-808IU酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)；Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

雄性SPF級(jí)Wistar大鼠32只，體質(zhì)量200 g±20 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2016-0019。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組、模型組、電療組和治療組4組各8例。

2.2 模型構(gòu)建

除正常組外，其他組大鼠均采用經(jīng)改良后的Videman法[8-9]構(gòu)建KOA模型，6周后每組隨機(jī)抽取1只大鼠處死并取關(guān)節(jié)軟骨觀察病理學(xué)變化，確定建模成功后進(jìn)行分組治療，正常組、模型組不給予任何治療。電療組造模成功1周后，采用中頻脈沖電療大鼠膝蓋周?chē)浗M織條索、硬結(jié)等部位，每天30 min，1周為1個(gè)療程，中間休息2 d，持續(xù)3周。治療組造模成功1周后，選取與電療組大鼠相同部位的3～5點(diǎn)作為內(nèi)熱針進(jìn)針部位，每周1次，持續(xù)3周。

2.3 樣本采集

腹腔注射戊巴比妥溶液(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈放血致死。收集大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜液用于ELISA檢測(cè)，收集膝關(guān)節(jié)軟骨組織，部分固定用于制作切片，剩余保存于-80 ℃。

2.4 HE染色

將固定液中的膝關(guān)節(jié)軟骨組織取出置于包埋盒中，脫水后浸蠟包埋。將蠟塊切成厚度為4 μm的切片，脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色 (hematoxylin-eosin staining，HE)。中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)變化。

2.5 膝關(guān)節(jié)滑膜液炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-17表達(dá)水平檢測(cè)

分別依照大鼠IL-1β、TNF-α和IL-17 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜液炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-17的表達(dá)水平。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)軟骨組織中Bcl-2及Bax表達(dá)水平

提取軟骨組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。引物由上海生物工程有限公司合成，序列如下：Bcl-2：F 5'-CACAGAGGGGCTACGAGT-3'，R 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGA-3'；Bax：F 5'-TGGTTGCCCTCTTCTA-3'，R 5'-CACCCTGGTCTTGGAT-3'；GAPDH：F 5'-AACAAGCAACTGTCCCTGAGC-3'，R 5'-GTAGACAGAAGGTGGCACAGA-3'。

2.7 Western bolt檢測(cè)軟骨組織中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

提取大鼠軟骨組織蛋白，定量后以20 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉1 h，PBS洗膜，分別加入Bcl-2、Bax及GAPDH抗體，室溫孵育1 h；PBS洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育0.5 h；PBS洗膜，加入化學(xué)放光試劑，曝光顯影。

2.8 TUNEL染色觀察軟骨組織中軟骨細(xì)胞凋亡水平

將固定液中的膝關(guān)節(jié)軟骨組織取出，脫水后浸蠟包埋。將蠟塊切成厚度為5 μm的切片，脫蠟后進(jìn)行TUNEL染色。中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察切片中軟骨細(xì)胞的凋亡水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察

正常組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞數(shù)目較多；模型組軟骨組織結(jié)構(gòu)散亂，軟骨細(xì)胞數(shù)目少，存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；電療組及治療組相較于模型組，軟骨組織結(jié)構(gòu)良好，軟骨細(xì)胞較多且炎性細(xì)胞減少(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色(200×)

3.2 ELISA檢測(cè)各組大鼠滑膜液炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-17含量

表1示，與正常組比較，模型組大鼠滑膜液中IL-1β、TNF-α和IL-17含量顯著增加(均P<0.01)；與模型組比較，電療組和治療組滑膜液中IL-1β、TNF-α和IL-17含量顯著降低(均P<0.01)；與電療組比較，治療組滑膜液中IL-1β和IL-17含量顯著降低(均P<0.01)，而TNF-α含量無(wú)顯著變化。

表1 各組大鼠滑膜液中IL-1β、TNF-α與IL-17含量比較

3.3 各組大鼠軟骨組織中Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表達(dá)

表2圖2示，與正常組比較，模型組大鼠軟骨組織中促凋亡基因Bax在mRNA及蛋白水平表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，電療組和治療組大鼠Bax表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)均顯著升高(均P<0.01)；與電療組比較，治療組大鼠Bax表達(dá)降低顯著(P<0.01)。且與模型組或電療組比較，治療組大鼠Bax/Bcl-2水平顯著降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠軟骨組織中Bcl-2及Bax在mRNA及蛋白水平表達(dá)比較

圖2 各組大鼠軟骨組織中Bcl-2及Bax蛋白印跡表達(dá)

3.4 TUNEL染色觀察各組大鼠軟骨組織中軟骨細(xì)胞凋亡水平比較

圖3示，與正常組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中軟骨細(xì)胞凋亡情況嚴(yán)重，而經(jīng)電療或內(nèi)熱針治療后，軟骨細(xì)胞凋亡現(xiàn)象得到緩解。

圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織TUNEL染色

4 討論

KOA始發(fā)部位為關(guān)節(jié)軟骨，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能障礙等[10]。針對(duì)KOA目前臨床尚未有特效或治愈的方法，其治療目的主要在于緩解臨床癥狀。骨關(guān)節(jié)炎國(guó)際研究學(xué)會(huì)的最新版治療指南強(qiáng)調(diào)藥物和非藥物聯(lián)合治療方法[11]，因此尋求治療KOA有效的聯(lián)合手段、改善其臨床癥狀成為目前預(yù)防保健與臨床治療研究的主要目標(biāo)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，內(nèi)熱針療法可溫經(jīng)散寒、活血通絡(luò)、緩解局部腫脹、松解黏連組織，加強(qiáng)針刺的作用[12]，使氣血調(diào)和、瘀去新生、經(jīng)脈通暢、通則不痛而病愈[13]。研究者陳先武等[14]采用內(nèi)熱針聯(lián)合膝關(guān)節(jié)腔灌洗術(shù)治療膝骨關(guān)節(jié)炎，結(jié)果治療組顯效率達(dá)80.76%，顯著高于正常組(膝關(guān)節(jié)腔灌洗術(shù))的61.53%。對(duì)120例膝骨性關(guān)節(jié)炎患者采用內(nèi)熱針聯(lián)合氨基葡萄糖膠囊的治療效果顯示，治療組總有效率顯著優(yōu)于正常組，且能有效降低外周血炎癥因子的表達(dá)，提示內(nèi)熱針能促進(jìn)氨基葡萄糖在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的吸收，改善組織內(nèi)缺血缺氧等現(xiàn)狀，進(jìn)而改善關(guān)節(jié)疼痛，提升治療效果[15]。內(nèi)熱針的顯著療效同樣在兔KOA模型中被證明[16]。而本研究通過(guò)內(nèi)熱針治療KOA大鼠的病理變化，結(jié)果顯示內(nèi)熱針對(duì)KOA模型大鼠的關(guān)節(jié)軟骨損傷具有一定的緩解及修復(fù)作用。

炎癥反應(yīng)是KOA常見(jiàn)的并發(fā)癥，降低炎癥反應(yīng)發(fā)生對(duì)軟骨組織的損傷修復(fù)具有積極意義[17]。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)熱針能顯著降低KOA模型大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜液中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-17的分泌，減少浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞數(shù)。龐青民等[18]采用針灸聯(lián)合獨(dú)活寄生湯加減治療KOA患者，結(jié)果顯示觀察組患者治療后血清中TNF-α、IL-6和IL-1的水平顯著低于正常組，提示此療法同樣可以明顯減輕KOA患者的炎癥反應(yīng)。程紅等[19]采用電針治療兔KOA模型，顯示電針可能通過(guò)抑制脊髓IL-17、IL-17R的表達(dá)來(lái)調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎性疼痛。此外，軟骨細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的功能退變與KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。孫鵬等[20]采用獨(dú)活寄生湯含藥血清治療KOA模型大鼠，結(jié)果顯示模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于正常組，而陽(yáng)性藥物組細(xì)胞凋亡數(shù)量較模型組顯著降低，提示該療法能抑制KOA軟骨細(xì)胞衰老、凋亡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞再生，從而達(dá)到治療的目的。吳晶金等[21]采用益氣養(yǎng)血方干預(yù)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示調(diào)控Bcl-2/Bax平衡、抑制IL-1β、TNF-α釋放可能是益氣養(yǎng)血方干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。而本研究同樣證明，內(nèi)熱針治療大鼠KOA模型能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)及抑制軟骨細(xì)胞凋亡達(dá)到緩解膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷的目的。且內(nèi)熱針治療能夠降低Bax的表達(dá)、促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控Bcl-2/Bax的平衡穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，內(nèi)熱針治療KOA的作用途徑可能是通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax平衡、減緩軟骨細(xì)胞的凋亡并降低炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。