徐俊濤，方玉甫，2△，王 瑩，王 麗，趙 巍

(1. 河南省中醫(yī)院，鄭州 450003； 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450000)

痤瘡是常見的慢性皮膚疾病之一，多發(fā)于青春期，好發(fā)于面部、胸口、背部等皮脂腺豐富處，常伴有瘙癢、疼痛、瘢痕等，且病情容易反復(fù)，嚴(yán)重影響患者身心健康[1]。痤瘡的發(fā)病機(jī)制尚未明了，普遍認(rèn)為與痤瘡丙酸桿菌(propionibacterium acnes，P.ances)誘發(fā)的免疫反應(yīng)有關(guān)[2]。目前，臨床用于痤瘡的局部用藥有維A酸類、過氧化苯甲酰、抗生素等，以維A酸類治療效果最好，但有致畸、致抑郁、肝損害的風(fēng)險[3]。因此，開發(fā)療效好、不良反應(yīng)小的痤瘡藥物具有重大臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能紊亂可能參與痤瘡炎癥的發(fā)生發(fā)展。P.ances可刺激T淋巴細(xì)胞異常增殖，過度分泌致炎因子和淋巴因子，機(jī)體免疫模式由Th1輔助細(xì)胞偏向Th2細(xì)胞[4]。最近研究表明，Toll樣受體家族(the toll-like receptor family，TRLs)在痤瘡炎癥中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。P.ances可激活TRLs，誘導(dǎo)一系列級聯(lián)反應(yīng)，活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)，最終導(dǎo)致局部炎癥[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，封髓丹加味治療上浮型玫瑰痤瘡療效較好[6]，但封髓丹加味與痤瘡的相關(guān)機(jī)制研究較少。本研究利用P.ances構(gòu)建痤瘡大鼠模型，首次基于Th1/Th2失衡及炎癥反應(yīng)探討封髓丹加味對痤瘡大鼠的影響，并初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

P.ances(菌種編號：ATCC6919)中國藥品生物制品鑒定所；多聚甲醛(R20493)、蘇木素(S19007)、伊紅(R24045)上海源葉生物科技有限公司；白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2，SBJ-R0757)、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ，SBJ-R0041)、白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4，SBJ-R0756)、白介素介素10(interleukin-10，IL-10)(SBJ-R0786)、

ELISA試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；蛋白一抗TRL2(ab209217，TRL4 ab8378)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)(ab32536)、p- NF-κB(ab86299)、β-actin(ab8226)，美國Abcam公司。

BX43光學(xué)顯微鏡(美國Olympus公司)；GelSMART凝膠成像儀(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)。

1.2 動物

SD雄性大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量200～240 g，由廣州弗爾博生物科技有限公司提供，動物許可證號SCXN(粵)2019-0015。大鼠自由攝食進(jìn)水，飼養(yǎng)于SPF級動物房中，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后用于實驗。本實驗已通過河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)實驗動物倫理委員會審查(批號1117-01)。

2 方法

2.1 造模

制備P.ances混懸液，調(diào)整細(xì)菌濃度值3×108/mL；于大鼠雙側(cè)耳廓皮下注射P.ances混懸液50 μL。注射24 h后觀察到耳廓組織出現(xiàn)紅腫，并有紅色丘疹形成；挑取耳廓腫脹部位組織做血平板培養(yǎng)，顯微鏡下觀察證實為P.ances感染。

2.2 分組與給藥

40只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和封髓丹加味低、中、高劑量治療組5組各8只。模型組和藥物治療組均注射P.ances混懸液構(gòu)建痤瘡大鼠模型，對照組以生理鹽水替代。封髓丹加味組成：(總量167 g)、砂仁20 g，黃柏、龜甲、龍骨、牡蠣、白茅根15 g，甘草、浮萍、茯苓皮、凌霄花、雞冠花12 g，附子、紅花6 g。將上述藥方換算為大鼠等效劑量15.90 g/(kg·d)，因此確定封髓丹加味低、中、高劑量分別為7.95、15.90、31.80 g/(kg·d)；按配比稱取各味藥物，加蒸餾水熬制并濃縮為7 g/mL，再稀釋為含生藥1.75 g/mL、3.5 g/mL及7 g/mL的中藥液作為低、中、高劑量。封髓丹加味低、中、高劑量治療組于建模后24 h灌胃給藥，對照組和模型組以蒸餾水替代，每天1次，連續(xù)灌胃7 d。

2.3 大體觀察

干預(yù)完成后觀察記錄各組大鼠耳部皮損情況(紅腫、丘疹等)并進(jìn)行皮損評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：耳廓注射部位無紅斑、丘疹及膿皰等，記為0分；耳廓注射部位以紅斑為主，記為1分；耳廓注射部位變現(xiàn)為紅斑、炎性丘疹，記為2分；耳廓注射部位變現(xiàn)為紅斑、炎性丘疹和膿皰，記為3分；耳廓注射部位紅斑面積大，大量炎性丘疹、膿皰且伴有較大膿腫，記為4分[7]。采用雙盲法進(jìn)行評分，取均值為最終結(jié)果。

2.4 組織病理觀察

干預(yù)完成后腹腔過量注射10%水合氯醛，窒息處死大鼠，迅速割取耳部注射處皮膚組織部分固定于多聚甲醛中，剩余凍存于液氮罐。耳廓組織固定后制備成石蠟切片，厚度約4 μm，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察耳部皮損處病理變化并計數(shù)炎癥細(xì)胞數(shù)量。

2.5 細(xì)胞因子水平檢測

于液氮罐中取出適量耳廓皮損組織，加入少量液氮快速研磨成粉末，冰上勻漿；參照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，檢測IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10含量。

2.6 TRL/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

于液氮罐中取出適量耳廓皮損組織，加入少量液氮快速研磨成粉末；加入裂解液提取皮損組織中的總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，再濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；浸于5%脫脂牛奶中封閉1 h，置于不同稀釋比的蛋白一抗(TRL 2∶1∶1000， TRL 4∶1∶1500，NF-κB：1∶1000，p- NF-κB：1∶1000，β-actin：1∶1000)中4 ℃反應(yīng)過夜，再置于稀釋比為1∶8000的二抗中室溫下反應(yīng)40 min；應(yīng)用凝膠成像儀顯示蛋白條帶，Image J軟件進(jìn)行灰度處理。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠耳部大體觀察及皮損評分比較

表1示，對照組大鼠雙側(cè)耳廓無變化，模型組大鼠耳廓明顯增厚、紅腫，耳部較硬且表面粗糙，有紅色丘疹；不同劑量封髓丹加味治療后大鼠耳廓增厚和紅腫癥狀有明顯改善，丘疹明顯消退，以高劑量組療效最顯著(如圖1)。各組大鼠耳廓皮損評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，封髓丹加味治療組皮損評分顯著降低(P<0.05)，具有濃度依賴性。

注：A.對照組；B.模型組；C.封髓丹加味低劑量治療組；D.封髓丹加味中劑量治療組；E.封髓丹加味高劑量治療組圖1 各組大鼠耳部皮膚觀察比較

表1 各組大鼠耳部皮損評分比較(分，

3.2 各組大鼠耳部組織病理變化及炎性細(xì)胞計數(shù)比較

圖2示，對照組大鼠耳部真皮內(nèi)少有細(xì)胞浸潤，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組真皮內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)內(nèi)伴有出血和水腫；封髓丹加味低、中、高劑量治療組炎性浸潤、間質(zhì)出血和水腫程度明顯減輕，且高劑量組減輕最明顯。各組大鼠皮損組織中炎性細(xì)胞計數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表2示，與模型組比較，封髓丹加味治療組炎性細(xì)胞計數(shù)顯著下降(P<0.05)。

注：A.對照組；B.模型組;C.封髓丹加味低劑量治療組；D.封髓丹加味中劑量治療組；E.封髓丹加味高劑量治療組圖2 各組大鼠耳部組織病理變化比較(HE×200)

表2 各組大鼠皮損組織中炎性細(xì)胞計數(shù)比較

3.3 各組大鼠耳部皮損組織細(xì)胞因子水平比較

表3示，各組大鼠皮損組織中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，封髓丹加味治療組IL-2、IFN-γ水平顯著上升，IL-4及IL-10水平顯著下降(P<0.05)，且具有濃度依賴性。

表3 各組大鼠皮損組織中細(xì)胞因子水平比較

3.4 各組大鼠耳部皮損組織TRL/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖3表4示，各組大鼠皮損組織中TRL2、TRL4及p-NF-ΚB/NF-ΚB的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，封髓丹加味治療組大鼠皮損組織中TRL2、TRL4及p-NF-ΚB/NF-ΚB的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，呈劑量依賴性。

注：a.對照組；b.模型組；c.封髓丹加味低劑量治療組；d.封髓丹加味中劑量治療組；e.封髓丹加味高劑量治療組圖3 各組大鼠皮損組織中TRL2、TRL4、p-NF-ΚB及NF-ΚB的蛋白印跡表達(dá)

表4 各組大鼠皮損組織中TRL2、TRL4及p-NF-ΚB/NF-ΚB表達(dá)比較

4 討論

痤瘡屬于中醫(yī)學(xué)“肺風(fēng)粉刺”“粉刺”等范疇。虛陽上浮型痤瘡病機(jī)為肺經(jīng)血熱、外遇風(fēng)寒，引起血瘀凝滯，主要涉及肺、胃、脾、腎等臟，癥狀表現(xiàn)為面部紅斑、灼熱，手足冰冷、畏寒，舌紅少苔等[8]。封髓丹出自鄭欽安的《醫(yī)理真?zhèn)鳌?，由黃柏、砂仁、甘草等組成，用于腎虛不固、風(fēng)火相扇者，能夠達(dá)到溫腎降火、活血消腫的功效[9]。研究報道，封髓丹加味具有溫腎潛陽、活血消腫之效，可有效改善紅斑、灼熱及水腫，可用于虛陽上浮型玫瑰痤瘡的治療[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，封髓丹加味可有效改善痤瘡大鼠耳廓增厚、紅腫及丘疹癥狀，減輕耳廓皮損組織中炎性浸潤、間質(zhì)出血和水腫程度，可能與封髓丹加味中砂仁、黃柏、龜板、附片及甘草納氣歸腎，茯苓皮、白茅根具有利水消腫之效有關(guān)[10]?，F(xiàn)代藥理研究也表明，封髓丹加味可能通過抑制神經(jīng)血管免疫反應(yīng)，減少痤瘡患者癥狀[11-12]。

痤瘡的發(fā)病機(jī)制具有多因素性和復(fù)雜性，主要因素有過度角化、炎癥反應(yīng)、皮脂腺調(diào)控異常等。近年來發(fā)現(xiàn)，免疫功能紊亂可能參與痤瘡炎癥的發(fā)生發(fā)展。痤瘡形成過程中，角質(zhì)形成細(xì)胞和皮脂腺細(xì)胞可表達(dá)多種細(xì)胞因子，如IL- 2、TNF- α及IFN-γ等，引起炎性細(xì)胞的趨化聚集[13]。Th1和 Th2細(xì)胞均為輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)，Th1細(xì)胞可分泌IL- 2、IFN-γ及腫瘤壞死因子-β等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞可分泌 IL- 4、IL- 10及IL- 13等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫[14]。IL- 4和IFN-γ是Th分化過程中的重要調(diào)控因子，Th1和Th2細(xì)胞可通過細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié)、抑制，達(dá)到動態(tài)平衡。Mélanie Saint-Jean 等[15]研究指出，Th1/Th2 失衡在痤瘡的發(fā)生發(fā)展中有關(guān)鍵作用，痤瘡患者存在Th1/Th2失衡，且與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡大鼠皮損組織中IL-2、IFN-γ水平明顯下降，IL-4及IL-10水平明顯上升，表明痤瘡大鼠體內(nèi)免疫模式由Th1細(xì)胞偏向Th2細(xì)胞。與崔力[16]等研究相符，提示封髓丹加味可糾正Th1/Th2失衡，從而減輕痤瘡癥狀。

Th1/Th2分泌的細(xì)胞因子位于TRL/NF-κB信號通路下游，TRL/NF-κB信號通路可通過下游炎癥因子調(diào)控免疫應(yīng)答[17]。另外研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞和皮脂腺細(xì)胞均可表達(dá)TRL2和TRL4，P.ances可激活TRLs的表達(dá)，從而活化NF-κB的表達(dá)，級聯(lián)式放大炎癥信號，破壞Th1和Th2 細(xì)胞因子的平衡，最終引起痤瘡炎癥[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，封髓丹加味治療后，痤瘡大鼠皮損組織中TRL2、TRL4及NF-κB磷酸化水平顯著降低，表明封髓丹加味可阻斷TRL/NF-κB信號通路，調(diào)控Th細(xì)胞因子的釋放，促使Th1和Th2細(xì)胞因子恢復(fù)平衡，從而改善痤瘡大鼠的炎性皮損狀態(tài)。

本研究初步探究了封髓丹加味對TRL/NF-κB信號通路及Th1/Th2平衡的影響，為闡明本方治療痤瘡的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。但封髓丹加味方中成分較多，具體是哪種成分干預(yù)痤瘡免疫尚不清楚；同時封髓丹加味治療痤瘡是否還具有其他作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步探究。