權(quán) 琦 陳 平 黃圓圓 張 蓓

中山大學(xué)腫瘤防治中心中醫(yī)科，廣東廣州 510060

乳腺癌是女性最常見的腫瘤。2018年全球乳腺癌新發(fā)病例數(shù)為208.9萬(wàn)，死亡人數(shù)為62.7萬(wàn)，均居女性惡性腫瘤第1位[1]。晚期乳腺癌的治療方式為化療、放療及靶向治療，但治療相關(guān)不良反應(yīng)多，影響患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)藥治療乳腺癌在扶正、祛邪、調(diào)動(dòng)機(jī)體抗病能力、減輕其他治療的副作用方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。中藥聯(lián)合放化療能提高患者的治療有效率、減輕不良反應(yīng)、改善生活質(zhì)量[2-3]。

皂角刺（Gleditsiae Spina）始載于《本草衍義補(bǔ)遺》，性溫味辛，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有消腫托毒、排膿、殺蟲等功效[4]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，皂角刺中黃酮類成分在多種實(shí)體瘤中有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，皂角刺單藥或聯(lián)合其他中藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞有具有細(xì)胞毒活性[5-6]。目前關(guān)于皂角刺抗腫瘤作用的研究主要集中在細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，缺乏更深層的機(jī)制研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥物作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)結(jié)合，建立疾病、靶點(diǎn)、藥物及通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而全面系統(tǒng)地分析藥物的作用機(jī)制[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可系統(tǒng)揭示中藥的活性成分及作用機(jī)制，反映中藥“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的特點(diǎn)，與中醫(yī)治療疾病的整體觀念和辨證論治理論相一致[8]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析皂角刺治療乳腺癌的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路，為進(jìn)一步深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

本研究流程見圖1。

圖1 預(yù)測(cè)皂角刺治療乳腺癌作用機(jī)制流程圖

1.1 皂角刺活性化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)

在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database（TCMSP）[9]中，以“皂角刺”為關(guān)鍵詞，口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為篩選條件，得到活性較高的化合物，并查詢對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2 乳腺癌的相關(guān)疾病靶點(diǎn)

在Genecards[10]及Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）[11]中，以“breast cancer/carcinoma/neoplasms”為關(guān)鍵詞，檢索乳腺相關(guān)的靶基因。

1.3 基因映射

利用Venn Diagram 數(shù)據(jù)包將皂角刺活性化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建PPI

借助String 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)[12]構(gòu)建PPI，獲取靶蛋白相互作用關(guān)系圖。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

使用R語(yǔ)言對(duì)皂角刺和乳腺癌共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得到皂角刺治療乳腺癌涉及的關(guān)鍵功能及通路。

1.6 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”和“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。將關(guān)鍵通路和富集在該通路中的蛋白導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)，并提取關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的子網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 皂角刺的化學(xué)成分及靶點(diǎn)結(jié)果

篩選得到高活性化合物11個(gè)（表1），對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)174個(gè)。

1.3 稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記 利用Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因引物檢測(cè)材料，引物名稱、序列及其擴(kuò)增片段預(yù)期大小見表 1。

表1 皂角刺含有的11種活性化合物基本信息

2.2 乳腺癌的相關(guān)疾病靶點(diǎn)結(jié)果

Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索出乳腺癌相關(guān)的疾病靶點(diǎn)1053 和527個(gè)。去除重復(fù)的共1132個(gè)。

2.3 基因映射結(jié)果

將皂角刺活性化學(xué)成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與乳腺癌的疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到映射靶點(diǎn)88個(gè)（圖2）。

圖2 皂角刺活性成分-抗乳腺癌作用靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI

通過(guò)String 平臺(tái)獲得PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3A），篩選出前30名的關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖3B）。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

以P＜0.01 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得GO 生物學(xué)過(guò)程條目104條，KEGG 相關(guān)信號(hào)通路144條。GO富集結(jié)果提示，皂角刺作用于乳腺癌涉及的分子功能主要包括：細(xì)胞因子受體結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性和RNA 聚合酶Ⅱ特異性激酶調(diào)節(jié)活性、受體配體活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性等（圖4A）。KEGG通路富集結(jié)果提示，靶點(diǎn)主要富集于各種癌癥、感染、細(xì)胞凋亡和TNF信號(hào)通路等（圖4B）。

圖3 PPI

2.6 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”和“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

在“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中（圖5），網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得出各節(jié)點(diǎn)degree值，排名前5位的化合物是：槲皮素（quercetin）、非瑟酮（fisetin）、山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）?！鞍悬c(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中（圖6）中，關(guān)鍵靶點(diǎn)有3個(gè)富集在關(guān)鍵通路中，靶點(diǎn)依次為：MAPK1、AKT1、RELA，通路包括癌癥、細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、感染、IL-17 信號(hào)通路和內(nèi)分泌抵抗。

圖4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析獲得3個(gè)關(guān)鍵化合物：槲皮素、非瑟酮和山奈酚，均為黃酮類化合物。皂角刺中的黃酮類化合物能從多個(gè)方面抑制乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展[13]。有研究報(bào)道，槲皮素能將腫瘤細(xì)胞周期阻滯在S期并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。非瑟酮可以激活半胱氨酸蛋白酶，抑制AuroraB 激酶，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡[15]。Azevedo 等[16]報(bào)道，山柰酚對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞有抗增殖和細(xì)胞毒效應(yīng)。由此可見，皂角刺中多種活性成分可抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，從而發(fā)揮治療乳腺癌的作用。

本研究結(jié)果顯示，MAPK1、AKT1、RELA是皂角刺治療乳腺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。MAPK1 又稱ERK2，是Ras/Raf/ERK 通路中較為重要的因子，ERK2 蛋白在乳腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率較高[17]，可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、血管新生和介導(dǎo)耐藥等促進(jìn)腫瘤發(fā)展，抑制ERK2是一種具有潛力的治療靶點(diǎn)。AKT 在乳腺癌等多種惡性腫瘤中以異?；罨问酱嬖冢纱龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，是抗乳腺癌藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)[18]。核因子RELA（p65）是NF-κB家族成員，在受到信號(hào)刺激進(jìn)入細(xì)胞核后調(diào)控下游基因，激活細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄功能引起細(xì)胞增殖。研究表明，沉默p65 基因可使乳腺癌細(xì)胞增殖受抑制，并能夠引起細(xì)胞凋亡，P65 蛋白在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較高，且與不良預(yù)后密切相關(guān)[19-20]。

圖5 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

圖6 “靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)本研究結(jié)果預(yù)測(cè)皂角刺治療乳腺癌的作用機(jī)制為：槲皮素、非瑟酮、山奈酚，通過(guò)靶向癌癥、細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、感染、IL-17信號(hào)通路和內(nèi)分泌抵抗等通路的MAPK1、AKT1、RELA 靶點(diǎn)起作用。

本研究利用生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)分析的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建直觀地顯示皂角刺治療乳腺癌具有多靶點(diǎn)、多途徑共同作用的特點(diǎn)。研究結(jié)果為一種分子機(jī)制上的預(yù)測(cè)探討，具體作用機(jī)制的確認(rèn)需進(jìn)一步驗(yàn)證。在后續(xù)研究中擬進(jìn)一步探討皂角刺在復(fù)方用藥中抗乳腺癌的作用機(jī)制，并對(duì)核心靶點(diǎn)和機(jī)制進(jìn)一步做實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為皂角刺在乳腺癌治療中的作用提供更有效、更深入的論證。