葛 欣 劉妍妍 劉 平

山東省滕州市中心人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東滕州 277500

伏立康唑（Voriconazole）是新型第2代三唑類廣譜抗真菌藥，為氟康唑的衍生物，是治療侵襲性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）的一線藥物[1]。由于伏立康唑的體內(nèi)藥代動力學(xué)呈非線性，并且受藥物代謝酶肝臟細胞色素P450（CYP）2C19 基因多態(tài)性和潛在的藥物相互作用影響，因此其體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)和血藥濃度具有較大的個體差異[2-3]。研究表明，伏立康唑的藥物濃度與其治療效果及用藥不良反應(yīng)高度相關(guān)，因此有必要對其進行治療藥物濃度監(jiān)測，以提高該藥物的應(yīng)用安全性和有效性，實現(xiàn)臨床個體化用藥[4]。目前已有文獻報道的伏立康唑藥物濃度監(jiān)測方法主要為高效液相色譜（HPLC）法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[5-20]。本試驗旨在建立一種簡便、快速、準確、高專屬性、高靈敏度的測定伏立康唑血藥濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，并應(yīng)用于臨床，從而保障用藥安全有效，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity I-Class 超高效液相色譜儀、Sample Manager FTN自動進樣器、Binary Solvent Manager 二 元泵、Xevo TQD 三重四級桿質(zhì)譜儀、電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）及Masslynx 4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore公司）；Eppendorf5804R 低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；BSA224S 電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；MD 200-2 氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；IKA-MS3 渦旋混合器（德國IKA 公司）。

1.2 藥品及試劑

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）；乙酸乙酯（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，北京百靈威科技有限公司，純度：97.0%）；水為超純水，由實驗室超純水機自制；對照品：伏立康唑（北京百靈威科技有限公司，純度：98.0%；批號：942087）、內(nèi)標氟康唑（中國食品藥品檢定研究院，純度：99.7%；批號：100314-201605）；空白血漿由山東省滕州市中心人民醫(yī)院檢驗科提供，為無菌采制；抗凝劑為EDTA K2，符合各項質(zhì)量標準。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Acquity UPLCRBEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：水（含0.1%甲酸及2 mmol/L 甲酸銨，A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～3 min，50%A；3～4 min，50%→2%A；4～4.5 min，2%A；4.5～5 min，2%→50%A）；流速：0.1 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI；正離子電離模式（ESI+）；毛細管電壓：2.88 kV；錐孔電壓：28 V；錐孔溫度：110℃；離子源溫度：450℃；脫溶劑氣氮氣（N2）流速：500 L/h；錐孔反吹氣流速：50 L/h；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（multi reaction monitoring，MRM）掃描；用于定量分析的離子對分別為m/z 350.0→126.9（伏立康唑）和m/z 307.0→219.9（內(nèi)標）。

2.3 溶液的配制

分別精密稱取伏立康唑10 mg 和氟康唑1 mg，分別置于10 mL 量瓶和100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別獲得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的伏立康唑儲備液和質(zhì)量濃度為10 μg/mL的氟康唑儲備液。

精密取伏立康唑儲備液適量，用甲醇依次稀釋，得到伏立康唑質(zhì)量濃度分別為20、100、500、1000、2000、4000、6000、8000、20 000 ng/mL的對照品系列溶液，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

精密取氟康唑儲備液適量，用甲醇稀釋成2.0 μg/mL的氟康唑內(nèi)標溶液，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品的處理

精密吸取血漿樣品100 μL，置于1.5 mL 離心管中，加入“2.3”項下的氟康唑內(nèi)標溶液（質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL）50 μL，加入0.1 mmol/L 氫氧化鈉溶液（pH=10）50 μL，渦旋1 min，加入乙酸乙酯1 mL，渦旋5 min，于13 000 r/min（離心半徑r=6 cm）低溫離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，以N2吹干，殘渣以乙腈-甲醇（75:25）100 μL 復(fù)溶，再以13 000 r/min（離心半徑r=6 cm）離心5 min，取上清液1 μL 進樣分析。

2.5 血樣的采集

12例深部真菌感染患者連續(xù)給藥3 d后，于第4天給藥前1 h 采集患者外周靜脈血2～4 mL 至EDTA 抗凝管中，于3000 r/min（離心半徑r=6 cm）低溫離心5 min，取上層血漿，按“2.4”項下方法處理后，進樣分析。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性分別取6份來自不同患者的空白血漿樣本、空白血漿+伏立康唑+內(nèi)標、患者給藥后的血漿樣本+內(nèi)標，按“2.4”項下方法處理后，進樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，伏立康唑和內(nèi)標的色譜峰峰形良好，分離完全，其保留時間分別為1.56、1.08 min，空白血漿在伏立康唑和內(nèi)標出峰處均無雜質(zhì)峰干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6.2 標準曲線與定量下限分別精密吸取空白血漿50 μL 至1.5 mL 離心管中，加入“2.3”項下的伏立康唑?qū)φ掌废盗腥芤?0 μL，混勻，配制質(zhì)量濃度為10、50、250、500、1000、2000、3000、4000、10 000 ng/mL 系列伏立康唑血漿標準曲線樣品，按“2.4”項下方法處理，每一份質(zhì)量濃度樣本平行測定2份，記錄色譜圖。

以伏立康唑峰面積與內(nèi)標峰面積的比值Y 為縱坐標，伏立康唑質(zhì)量濃度X（ng/mL）為橫坐標，用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重系數(shù)W=1/X2）進行線性回歸，得回歸方程為Y=1.303 93×10-3X+1.002 17，r=0.9992。結(jié)果表明，該檢測方法在10～10 000 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量下限為10 ng/mL（S/N＞5），連續(xù)測定5份樣本，RSD 為4.96%。

2.6.3 精密度和準確度分別配置伏立康唑的定量限、低、中、高（10、25、1500、8000 ng/mL）4個濃度的血漿樣本。按“2.4”項下方法處理樣本，于同日內(nèi)每一質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本平行測定5份，連續(xù)測定3 d。根據(jù)當日標準曲線計算各樣本的濃度，考察方法的準確度和日內(nèi)、日間精密度，準確度通過計算測定濃度與理論濃度的百分比獲得，精密度通過計算RSD 獲得，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間RSD 均＜7%，準確度在95.2%～104.8%。精密度和準確度考察結(jié)果均合格。

圖1 血漿樣品的典型LC-MS/MS 色譜圖

表1 方法精密度和準確度的考察結(jié)果

2.6.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取“2.6.3”項下的低、中、高（25、1500、8000 ng/mL）3個濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4”項下方法操作，每一份質(zhì)量濃度樣本平行測定6份，獲得相應(yīng)峰面積（A）。同時另取空白血漿100 μL，按“2.4”項下方法處理至取上清液后，加入“2.3”項下的伏立康唑?qū)φ掌啡芤汉蛢?nèi)標溶液配制成濃度為25、1500、8000 ng/mL的樣品，進樣獲得相應(yīng)峰面積（B），每一質(zhì)量濃度樣本平行測定6份。同時另取100 μL 流動相代替空白血漿，按上述方法處理，獲得相應(yīng)峰面積（C），每一質(zhì)量濃度樣本平行測定6份。按上述3種方法得到內(nèi)標峰面積分別為A、B 和C。計算公式為：伏立康唑的提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%；內(nèi)標提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見表2。結(jié)果表明，伏立康唑的質(zhì)控樣品和內(nèi)標的提取回收率最小為（75.3±3.25）%，最大為（89.2±5.02）%，基質(zhì)效應(yīng)最小為（86.2±8.32）%，最大為（115.3±7.29）%，RSD 均＜5%，考察結(jié)果合格。

表2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果（n=6）

2.6.5 穩(wěn)定性考察 取“2.6.3”項下的低、中、高（25、1500、8000 ng/mL）質(zhì)量濃度的伏立康唑血漿質(zhì)控樣本，在室溫放置24 h，處理后自動進樣器（4℃）放置24 h，反復(fù)凍融3次，于-80℃環(huán)境中冷凍保存60 d后，測定樣品的穩(wěn)定性，每個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本平行測定5份。結(jié)果顯示，在上述條件下，伏立康唑的質(zhì)控樣品回收率為92.7%～102.5%，RSD 為4.7%～6.5%。結(jié)果表明，在上述穩(wěn)定性考察條件下，伏立康唑穩(wěn)定性良好。

2.6.6 伏立康唑的血藥濃度監(jiān)測 收集12例山東省滕州市中心人民醫(yī)院收治的重癥真菌感染患者，其中，男10例，女2例；年齡49～83歲，平均（65±18）歲；肺部感染10例，腹腔感染2例。患者均經(jīng)臨床醫(yī)師診斷需要伏立康唑片（商品名：威凡，輝瑞制藥有限公司，規(guī)格：0.2 g/片，生產(chǎn)批號：C20190532）治療，在3～4個維持劑量后，在下一次給藥前1 h 于對側(cè)抽取靜脈血2～4 mL 置于EDTA 抗凝管中，3000 r/min（離心半徑r=6 cm）離心10 min，取上層血漿，按照“2.4”項下方法處理，進樣，測定結(jié)果見表3。其中患者的穩(wěn)態(tài)谷濃度最大值為9054.24 ng/mL，最小值為817.29 ng/mL。有4例患者的血藥濃度不在推薦治療濃度范圍內(nèi)，患者出現(xiàn)惡心、發(fā)熱、皮疹、肝功能異常等明顯不良反應(yīng)。結(jié)合患者發(fā)生的不良反應(yīng)和用藥情況，已及時反饋給臨床醫(yī)師，從而對治療方案進行調(diào)整。

表3 12例患者的臨床資料及谷濃度測定結(jié)果

3 討論

目前國內(nèi)外測定伏立康唑藥物濃度的方法主要為HPLC 法和LC-MS/MS 法[5-20]，由于LC-MS/MS 法在專屬性、靈敏度、檢測效率上的優(yōu)勢，已成為近年來治療藥物監(jiān)測的首選方法。LC-MS/MS 法中，樣品前處理方法包括固相萃取、液液萃取和蛋白質(zhì)沉淀法[10]。由于蛋白質(zhì)沉淀法通常產(chǎn)生較大的基質(zhì)效應(yīng)，而固相萃取成本較高且費時費力[11]，本試驗采用液液萃取法。已有文獻報道的液液萃取的萃取劑包括二氯甲烷、叔丁基甲醚、乙醚-二氯甲烷、乙醚等[5-20]，本方法采用毒性較小且安全性較好的乙酸乙酯，經(jīng)驗證提取回收率>75%，基質(zhì)效應(yīng)最小為（86.2±8.32）%，最大為（115.3±7.29）%，符合生物樣本測定要求。由于伏立康唑為弱堿性藥物，可加堿性試劑調(diào)節(jié)pH值以提高萃取率[5-10]。經(jīng)本試驗驗證，調(diào)節(jié)溶液pH=10時，萃取率達到最高。LC-MS/MS 法中內(nèi)標選取通常以穩(wěn)定同位素內(nèi)標為佳[13]，但價格較為昂貴，本方法采用結(jié)構(gòu)相似的氟康唑作為內(nèi)標，其質(zhì)譜、色譜條件與伏立康唑較為接近，且信號強、穩(wěn)定性好。綜上所述，本研究所建立的檢測方法安全、經(jīng)濟、有效，可為伏立康唑臨床合理用藥提供支持。

根據(jù)《中國伏立康唑個體化用藥指南推薦意見》，推薦中國人群目標血藥谷濃度范圍為0.5～5 μg/mL[22]。通過對12例患者的伏立康唑血藥濃度進行監(jiān)測，并結(jié)合臨床分析，可認為伏立康唑谷濃度及治療時間與其不良反應(yīng)高度相關(guān)。若伏立康唑血藥濃度超過5 μg/mL，其藥物不良反應(yīng)發(fā)生率大大增加。伏立康唑具有非線性藥代動力學(xué)特點，并且由于15%～20%的亞洲人屬于CYP2C19 肝藥酶弱代謝者，且患者的年齡、體質(zhì)量、肝功能都會影響伏立康唑的代謝，因此同一劑量會造成不同人群伏立康唑血藥濃度的較大差異。由于本項研究大部分患者為老年患者，病情較為危重，且存在肝藥酶、血漿白蛋白等水平上的差異，同時受基礎(chǔ)疾病和聯(lián)合用藥的影響，在臨床上應(yīng)結(jié)合CYP2C19 基因多態(tài)性、患者個體資料、藥物相互作用等因素對患者進行個體化給藥設(shè)計。由于伏立康唑谷濃度個體差異大，臨床上可按照體重給藥[22]，有助于提高其血藥濃度達標率。未來研究還需要擴大樣本量和進一步的分析加以確認和證實。