楊秀，鄧艷鳳，肖水平，劉新穩(wěn)，王濤，楊紹群

(江西省棉花研究所/國家棉花產(chǎn)業(yè)技術體系鄱陽湖綜合試驗站，江西 九江 332105 )

土壤鹽堿化會引起離子毒性、高滲透脅迫和氧化等次生脅迫從而對植物造成危害[1]。但植物為了應對惡劣的環(huán)境在高鹽條件下進化出很多調節(jié)植物生長的機制[2]。其中一個關鍵機制涉及到植物細胞中的鈣濃度升高和鈣依賴信號通路[3]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣調磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like proteins)基因在植物非生物逆境應答以及鈣信號轉導過程發(fā)揮重要的作用。CBL蛋白包含EF-hand基序，與Ca2+結合時，它們發(fā)生構象變化，并與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(CIPK)特異性相互作用，形成CBL-CIPK通路，被廣泛認為是植物響應和適應不同外部壓力觸發(fā)Ca2+信號的主要機制[4-6]。此外，CBL-CIPK已被證明是調節(jié)植物對多種非生物脅迫(如高鹽、K+缺乏、Mg2+過量和干旱)的重要信號網(wǎng)絡[7-8]。它還調節(jié)植物的生長和發(fā)育，硝酸鹽、銨和鐵的吸收和運輸，維持H+的穩(wěn)態(tài)，以及活性氧信號的轉導。

到目前為止，關于CBL蛋白功能的研究很多，擬南芥中的研究最為深入。在擬南芥中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了編碼CBL蛋白的10個基因[4]。其中鈣調磷酸酶B亞基蛋白4(CBL4/SOS3)、CBL相互作用蛋白激酶24(CIPK24/SOS2)和SOS1組成的SOS途徑是通過將Na+擠壓到細胞外空間，從而使植物具有耐鹽性，控制細胞離子平衡[9-10]。CBL10-CIPK8復合物通過激活擬南芥幼苗中SOS1途徑，使Na+外排，從而提高擬南芥的耐鹽能力[11]。過表達擬南芥CBL5使植物在發(fā)育早期對高鹽或高滲透脅迫具有更強的抵抗力，但沒有改變它們對ABA的反應[12]。此外，CBL2和CBL3還參與調控植物種子產(chǎn)量和大小，并且與CIPK3/9/23/26構成了一個多價的相互作用網(wǎng)絡，調控Mg2+的空泡隔離，從而保護植物免受Mg2+毒性[13-15]。AtCBL1還在鹽和干旱環(huán)境下發(fā)揮正向調節(jié)作用，而在冷脅迫反應中發(fā)揮負向調節(jié)作用[16]。CBL9還參與植物對ABA、K+缺失的響應過程，并通過減少胞內游離鈣濃度負調控耐寒性[17-19]。擬南芥CBL7還參與調控植物對低硝酸鹽的反應[20]。目前，小麥[21]、水稻[22]、大白菜[23]、杜梨[24]、番茄[25]、陸地棉[26]等植物在全基因組水平上檢測到多個CBL基因家族，且CBL蛋白含有EF-hands、myristoylation和palmitoylation sites等保守結構域[4, 27]，并且研究了許多CBL基因在不同組織中的表達模式，以及在植物對各種非生物脅迫的響應[27, 28]。這些研究成果為人們進一步探索CBLs在植物中的作用機制奠定了基礎。然而，關于亞洲棉CBLs的基因組學和進化研究還很少。因此，作者利用生物信息學的方法，在亞洲棉基因組序列的基礎上，以CBL家族蛋白質結構域為搜索條件，鑒定亞洲棉中CBL基因，對CBL基因成員的理化性質、進化關系、基因結構、蛋白結構、染色體定位、順式作用元件進行分析，為進一步探索棉花CBL基因的功能提供線索。

1 材料與方法

1.1 亞洲棉CBL家族成員鑒定與理化性質分析

從phytozom (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/)下載水稻的CBL蛋白，而擬南芥的CBL蛋白從TAIR(http://www.arabidopsis.org/)下載。利用擬南芥和水稻CBL家族蛋白序列，在CottonGen數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/)中比對亞洲棉CBL蛋白序列，人工去除冗余蛋白序列，利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)、CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和PFAM(http://pfam.sanger.ac.uk/) 預測并分析上述候選蛋白序列的保守結構域，剔除不含完整保守結構域的序列，同時，利用COTTON FGD (http://www.cottonfgd.org/)數(shù)據(jù)庫對亞洲棉CBL基因的染色體位置及其編碼產(chǎn)物的相對分子質量和理論等電點等基本信息進行分析。

1.2 亞洲棉CBL基因家族系統(tǒng)進化、基因結構和染色體定位分析

利用Clustal X 2.0(http://www.clustal.org/clustal2/)程序對獲得的擬南芥、水稻、亞洲棉的CBL蛋白序列進行多序列比對[29]，利用MEGA 6.0軟件生成.meg格式文件，然后采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹，其Bootstrap method值設為1000，其余參數(shù)設為默認值。利用MapChart 2.2[30]軟件對亞洲棉CBL家族基因進行染色體定位。GaCBL基因家族成員的外顯子-內含子結構通過基因結構分析軟件分析(Gene Structure Display Server, GSDS 2.0)[31]。

1.3 亞洲棉CBL蛋白基序和保守結構域分析

CBL蛋白序列的保守基序分析采用MEME在線軟件預測，參數(shù)設置如下：“Maximum number of motifs”為15，“Occurrences of a single motif”為“zero or one per sequence”，采用CDD(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)數(shù)據(jù)庫查找CBL的保守結構域信息，利用TBtool作圖工具繪制保守結構域。

1.4 亞洲棉CBL家族基因的順式作用元件分析

利用棉花基因組數(shù)據(jù)庫Cotton FGD(http://www.cottonfgd.org/)提取陸地棉CBL基因序列轉錄起始位點ATG上游1500 bp序列，然后將獲得的序列提交到Plant CARE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)數(shù)據(jù)庫中，鑒定啟動子區(qū)域可能存在的順式作用元件。

2 結果與分析

2.1 亞洲棉CBL家族成員的鑒定與理化性質

利用BLASTP和HMMER搜索獲得候選氨基酸序列，并用Pfam、SMART和CDD工具篩選候選氨基酸序列，剔除不含EF-hand結構域的冗余序列，最終獲得20個亞洲棉CBL基因。根據(jù)CBL基因所在的染色體位置和前人的研究，并以GaCBL1-1形式將其命名，所有基因家族成員的基因名字和理化性質如表1。研究分析發(fā)現(xiàn)亞洲棉CBL基因家族成員的編碼基因組序列差異較大(241～11123 bp)，而編碼序列長度差異較小(199～786 bp)，這可能與內含子-外顯子結構的不同有緊密的關系。從表1中還可以看出，基因編碼產(chǎn)物的理論等電點(pI)、相對分子質量大小差異不大，表明棉花CBL蛋白的理化性質差異不大；除GaCBL4-3(等電點為8.241)和GaCBL2-2(等電點為6.241)以外，其余CBL蛋白的等電點為4～5.5，表明CBL蛋白中的氨基酸大部分為酸性。在亞洲棉CBL的家族成員中，除GaCBL2-3、GaCBL2-4、GaCBL2-5、GaCBL2-6、GaCBL3-2、GaCBL4-2和GaCBL9的總平均疏水性得分為陽性外，其余GaCBL得分為陰性，說明大多數(shù)GaCBL蛋白為親水性蛋白。

2.2 亞洲棉CBL基因家族的系統(tǒng)進化分析

為了確定CBL蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關系，采用鄰近法(NJ)，將完整的CBL蛋白序列用MEGA6.0進行比對，構建系統(tǒng)進化樹(圖1)。系統(tǒng)進化樹將亞洲棉的CBL蛋白與擬南芥、水稻的CBL蛋白分成了兩個組，其中Group II包含的成員最多，Group I中僅有GaCBL4-1、GaCBL4-2、GaCBL4-3和GaCBL8共4個成員。Group I包含的成員數(shù)量雖少，但在不同的物種中均存在，說明該組成員可能參與了植物體的某種生物學過程。

表1 亞洲棉CBL家族基因的理化性質

圖1 擬南芥、水稻、亞洲棉CBL基因家族系統(tǒng)進化樹

2.3 亞洲棉CBL基因家族成員基因和蛋白結構分析

在基因結構分析中，大部分亞洲棉CBL基因結構被內含子破壞。在不同的基因中被破壞程度不同，被內含子高度打斷的基因包括GaCBL8、GaCBL4-1、GaCBL4-2、GaCBL10-1、GaCBL10-2、GaCBL1-2、GaCBL1-3、GaCBL9、GaCBL1-1、GaCBL3-1、GaCBL2-1和GaCBL1-1，占超過55%的亞洲棉CBL基因。其余的CBL基因最多有4個內含子。此外，根據(jù)基因結構將CBL基因家族成員分為2組，這與系統(tǒng)進化樹的分組高度一致。同一組內各基因中的外顯子-內含子結構比較相似，而不同組的基因結構差異較大。這表明基因結構與它們的遺傳進化關系密切。

通過結構域分析發(fā)現(xiàn)所有的CBL基因均含有至少一個EF-hand結構域，且除了該結構域以外，不含有其他結構域。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，同一類群中的大多數(shù)成員具有相似的motif，說明同一類群中的基因存在著功能上的相似性。

圖2 亞洲棉CBL家族基因結構分析

圖3 亞洲棉CBL家族基因蛋白結構分析

2.4 亞洲棉CBL基因家族染色體定位

為了確定CBL家族基因在染色體上的分布，對CBL基因進行染色體定位(圖4)。結果表明18個CBL基因被定位在10條染色體上，而GaCBL2-5和GaCBL2-6顯然不能定位到任何染色體上。且基因在染色體上的位置相對不均勻，在9號和11號染色體的下端處分布較密。

圖4 亞洲棉CBL家族基因在染色體上的位置

2.5 順式作用元件分析

對GaCBL基因的啟動子區(qū)域上游的1500 bp序列進行順式作用元件分析，我們發(fā)現(xiàn)GaCBL家族基因成員啟動子區(qū)域中均含有多個能夠應答逆境和植物激素的順式作用元件，包括ABA反應元件(ABRES)、低溫應答元件(LTRS)、病原物防御和應激反應元件(TC-rich repeats)、茉莉酸甲酯應答元件(CGTCA-motif 和TGACG-motif)、水楊酸應答元件(TCA-element)、干旱誘導元件(MBS)(表2)，這說明亞洲棉CBL基因可能參與多種非生物脅迫和激素應答過程，具有復雜的生物學功能。其中GaCBL1-2不僅含有脫落酸應答元件(ABRES)、干旱應答元件(MBS)和低溫應答元件(LTRS)等非生物逆境應答元件，還含有病原物防御和應激元件(TC-rich repeats)等，推測該基因可能參與ABA、低溫及各種生物脅迫應答。從表2中還可以發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯應答元件(TGACG-motif)是CBL基因啟動子中最豐富的順式調節(jié)激素應答元件，其中15個基因成員包含TGACG-motif，說明大多數(shù)的亞洲棉CBL基因參與茉莉酸甲酯的應答過程。

表2 亞洲棉CBL基因順式作用元件分析

續(xù)表2 亞洲棉CBL基因順式作用元件分析

3 討論與結論

目前關于棉花CBL基因的研究較少，關于亞洲棉CBL家族基因的研究鮮見報道。本研究通過生物信息學分析，從亞洲棉基因組中鑒定出20個CBL基因，并對這些基因的系統(tǒng)進化關系、基因和蛋白結構、染色體分布和順式作用元件進行分析。結果表明，亞洲棉CBL家族基因的理化性質差異不大，且大多數(shù)GaCBL蛋白為親水性蛋白；系統(tǒng)進化樹分析得出兩個組，Group II包含的成員最多，Group I中僅有GaCBL4-1、GaCBL4-2、GaCBL4-3和GaCBL8共4個成員。外顯子-內含子結構分析表明，大部分CBL基因有8～9個外顯子，且在同一組的基因中，外顯子-內含子結構比較相似，且組之間的基因結構差異較大。編碼區(qū)分析表明CBL基因均含有至少一個EF-hand結構域，且不含有其他結構域。染色體定位分析表明，20個CBL基因在基因組中的分布是不均勻的，9號和11號染色體上分布最多，在2號、4號、7號染色體上未發(fā)現(xiàn)。順式作用元件分析表明，所有的亞洲棉CBL基因都含有幾個或者多個應答不同逆境和植物激素的順式作用元件，且含有的順式作用元件的類型和數(shù)量各不相同，這說明亞洲棉不同CBL成員可能參與不同的生物學過程并發(fā)揮著不同的功能。這些結果可以為進一步克隆和研究亞洲棉CBL的功能提供參考。