鄭俊青，黎瑞源，鄭 冉，呂 丹，陳其皎，石桃雄，*，陳慶富

(貴州師范大學(xué) a. 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心；b. 生命科學(xué)學(xué)院；c. 貴州省信息與計(jì)算科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001)

苦蕎屬于蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill)植物，又名韃靼蕎麥(tartary buckwheat)，其種植區(qū)域在我國(guó)主要分布在云南、四川、貴州、陜西、山西、甘肅和寧夏，我國(guó)的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一[1]?？嗍w作為自然界藥食兩用的作物，集生物類黃酮、微量元素和礦物質(zhì)、淀粉、維生素、纖維素、脂肪和蛋白質(zhì)于一身[2]?？嗍w種子中的蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)[3]?？嗍w種子蛋白質(zhì)是苦蕎籽粒中主要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗腫瘤、降血壓、抑制絲氨酸蛋白酶等生理活性，是一種理想的健康食品原料[4]。研究資料表明，苦蕎和甜蕎種子蛋白中含有的人體必需氨基酸齊全，且配比合理，是一種全價(jià)蛋白，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-6]。

種子成熟過(guò)程中合成并貯存大量的貯藏蛋白質(zhì)，一般占種子總蛋白含量的80%左右[7]。Osborne[8]提取出種子貯藏蛋白質(zhì)，并按照溶解性的不同將其分為清蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(gliadin)和谷蛋白(gluten)4類。蕎麥蛋白組分含量表現(xiàn)為較高含量的清蛋白和谷蛋白，較低含量的球蛋白和醇溶蛋白[9-11]，不同于谷類作物小麥、水稻和玉米的蛋白組分含量(醇溶蛋白和谷蛋白含量高于清蛋白和球蛋白含量)[12-18]，與豆類作物蠶豆、綠豆蛋白組分含量(清蛋白含量較高)相近[19-22]。在食品加工方面，清蛋白和球蛋白可溶性強(qiáng)，富含賴氨酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高，主要影響籽粒的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，對(duì)加工品質(zhì)的影響甚微[23-25]；醇溶蛋白主要影響面團(tuán)的黏著性、延伸性[26]，影響蕎麥的加工品質(zhì)；谷蛋白主要決定面團(tuán)的彈性[27]，對(duì)蕎麥加工品質(zhì)起決定性作用。與小麥和玉米等作物相比，苦蕎的醇溶蛋白含量低，在制作發(fā)酵類主食時(shí)，不利于饅頭或其他類面筋的形成[2]。郭榮榮[28]研究表明，甜蕎谷蛋白對(duì)火腿腸的色澤具有顯著影響，清蛋白影響火腿腸的凝膠強(qiáng)度，添加清蛋白和谷蛋白可以改善火腿腸的彈性和內(nèi)聚性。在醫(yī)療保健方面，小麥、大麥等谷物中的醇溶蛋白是誘發(fā)乳糜瀉腸道疾病的主要原因，蕎麥的醇溶蛋白含量低，致病性低，是腹腔患者可以信賴和推崇的安全食物[29-31]。張超等[32]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎球蛋白抗疲勞效果顯著。左光明等[33]的研究表明，苦蕎清蛋白降血脂和體內(nèi)抗氧化功能較強(qiáng)。

苦蕎粒形包括粒長(zhǎng)、粒寬和長(zhǎng)寬比等性狀，是苦蕎(米)外觀品質(zhì)性狀的重要表現(xiàn)形式，同時(shí)也是決定粒重進(jìn)而影響苦蕎產(chǎn)量的重要因素。目前關(guān)于苦蕎蛋白組分含量與粒重和籽粒性狀相關(guān)性的研究報(bào)道較少。朱新產(chǎn)等[34]研究3個(gè)甜蕎品種和3個(gè)苦蕎品種發(fā)現(xiàn)，大粒蕎麥(千粒重30～35 g)粗蛋白含量顯著高于小粒蕎麥(千粒重25～30 g)，說(shuō)明千粒重影響營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。本研究以晉蕎麥2號(hào)與小米蕎雜交衍生獲得的苦蕎重組自交系(XJ-RILs)群體為試驗(yàn)材料，調(diào)查了該群體220個(gè)株系的粒形性狀和蛋白組分含量的遺傳變異，分析了籽粒性狀和蛋白組分含量的相關(guān)性，篩選出各蛋白組分含量和總蛋白含量極端株系，為不同食品和保健品的加工需求提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以小米蕎為母本，晉蕎麥2號(hào)為父本，雜交衍生的重組自交系(XJ-RILs)群體220份F7:8株系為試驗(yàn)材料。小米蕎是云南地方品種，薄殼，易脫殼，晚熟，適應(yīng)性差，產(chǎn)量低；晉蕎麥2號(hào)是山西省選育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種，厚殼、不易脫殼，早熟，適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高[35]。

1.2 田間種植

試驗(yàn)于2018年8月在貴州省貴陽(yáng)市百宜鎮(zhèn)試驗(yàn)基地進(jìn)行，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，包含3次重復(fù)，小區(qū)面積為2 m2，3行區(qū)種植，常規(guī)田間管理。

1.3 粒重和粒形測(cè)定

千粒重、粒長(zhǎng)、粒寬和長(zhǎng)寬比用SC-A型考種分析測(cè)定儀(杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 蛋白提取

蕎麥種子蛋白組分的提取采用順序提取法。稱取蕎麥粉末0.500 g置于5 mL離心管中，先用0.01 mol·L-1Tris-HCl溶液(pH=7.5)提取清蛋白，再用0.01 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.5)和0.5 mol·L-1NaCl混合溶液提取球蛋白；重新稱取蕎麥粉末0.500 g置于5 mL離心管中，先用60%正丙醇溶液提取醇溶蛋白，再用0.5%酒石酸鈉、0.24%硫酸銅、1.68%氫氧化鉀和50%正丙醇混合溶液提取谷蛋白。具體的提取步驟參考張啟迪等[36]的方法。

1.5 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和總蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定苦蕎種子中各蛋白組分含量?？偟鞍缀拷茷?種蛋白組分含量之和。

1.6 數(shù)據(jù)處理

苦蕎XJ-RILs群體各性狀的平均值、最大值、最小值、峰度、偏度、變異系數(shù)等描述統(tǒng)計(jì)量采用Excel 2016進(jìn)行分析，用SPSS 24.0進(jìn)行親本間各性狀的方差分析、XJ-RILs群體各性狀的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析、類群間的方差分析(F檢驗(yàn))、多重比較(Duncan法)。分別用R3.2.2統(tǒng)計(jì)軟件(https://www.R-project.org/)的scale、dist和hclust函數(shù)完成群體各性狀的標(biāo)準(zhǔn)化和中心化、基于歐氏距離的相似性矩陣構(gòu)建和基于離差平方和法(Ward)的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎XJ-RILs群體粒形與蛋白組分含量變異

親本間各調(diào)查性狀的方差分析(表1)表明，父本晉蕎麥2號(hào)千粒重、粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比、清蛋白、球蛋白、谷蛋白和總蛋白含量均顯著(P<0.05)高于母本小米蕎；雙親間醇溶蛋白含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。雙親蛋白組分含量高低清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。

苦蕎XJ-RILs群體粒形性狀中，千粒重變幅為11.88～26.73 g，平均值為18.17 g；粒長(zhǎng)變幅為4.05～5.73 mm，平均值為4.87 mm；粒寬變幅為2.78～3.64 mm，平均值為3.14 mm；長(zhǎng)寬比變幅為1.27～1.90，平均值為1.57。千粒重的變異系數(shù)最大，為17.13%；其次是長(zhǎng)寬比和粒長(zhǎng)，分別為10.62%和9.03%；粒寬的變異系數(shù)最小，為5.79%。

苦蕎XJ-RILs群體蛋白組分中，總蛋白含量變幅為44.61～114.20 mg·g-1，平均值為75.90 mg·g-1；清蛋白含量變幅為10.29～56.39 mg·g-1，平均值為34.10 mg·g-1；球蛋白含量變幅為5.68～13.48 mg·g-1，平均值為10.84 mg·g-1；醇溶蛋白含量變幅為2.51～7.42 mg·g-1，平均值為4.95 mg·g-1；谷蛋白含量變幅為7.83～47.20 mg·g-1，平均值為26.01 mg·g-1。谷蛋白含量變異系數(shù)最大，為29.97%；其次是清蛋白含量和醇溶蛋白含量，分別為24.03%和20.15%；再次是球蛋白含量，為16.07%；總蛋白含量變異系數(shù)最小，為15.30%。

粒長(zhǎng)和長(zhǎng)寬比的峰度絕對(duì)值均大于1，呈現(xiàn)近似的正態(tài)分布；其他7個(gè)性狀的偏度和峰度絕對(duì)值均小于1，符合正態(tài)分布。各性狀均存在明顯的雙向超親分離現(xiàn)象(圖1，表1)。

2.2 苦蕎XJ-RILs群體種子蛋白組分含量的基因型差異

苦蕎XJ-RILs群體種子蛋白組分含量存在明顯基因型差異，按照種子蛋白組分含量高低順序分為5種類型(表2)。其中，有160個(gè)株系(72.73%)和親本一致，各蛋白組分含量高低為清蛋白含量>谷蛋白含量>球蛋白含量>醇溶蛋白含量，谷蛋白含量的變異系數(shù)最大(27.65%)，總蛋白含量的變異系數(shù)最小(14.94%)；53個(gè)株系(24.09%)的谷蛋白含量>清蛋白含量>球蛋白含量>醇溶蛋白含量，其中醇溶蛋白含量的變異系數(shù)最大(23.03%)，總蛋白含量的變異系數(shù)最小(14.10%)；4個(gè)株系(1.82%)的清蛋白含量>球蛋白含量>谷蛋白含量>醇溶蛋白含量；2個(gè)株系的谷蛋白含量>清蛋白含量>醇溶蛋白含量>球蛋白含量；還有1個(gè)株系的清蛋白含量>谷蛋白含量>醇溶蛋白含量>球蛋白含量。

表1 苦蕎XJ-RILs群體粒重、粒形與蛋白組分含量變異

2.3 苦蕎XJ-RILs群體粒形與蛋白組分含量簡(jiǎn)單相關(guān)性分析

各性狀的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析表明(表3)，千粒重與粒長(zhǎng)、粒寬，以及球蛋白、谷蛋白和總蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與清蛋白呈顯著(P<0.05)正相關(guān)，與醇溶蛋白呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)；粒長(zhǎng)與長(zhǎng)寬比、谷蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與總蛋白含量呈顯著(P<0.05)正相關(guān)，與醇溶蛋白含量呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)；粒寬與球蛋白、總蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與長(zhǎng)寬比呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)；長(zhǎng)寬比與醇溶蛋白含量呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)，與谷蛋白呈顯著(P<0.05)正相關(guān)。清蛋白、球蛋白和谷蛋白均與總蛋白呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)；谷蛋白與球蛋白呈顯著(P<0.05)正相關(guān)，與醇溶蛋白呈顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)。

2.4 苦蕎XJ-RILs群體粒形與蛋白組分含量聚類分析

基于調(diào)查性狀的表型值對(duì)苦蕎XJ-RILs群體進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，在歐氏距離為12.10～13.50處，可將220個(gè)株系劃分為12個(gè)類群(圖2)。類群間各性狀的方差分析(表4)表明，C7、C8、C10、C11和C12類群的千粒重顯著(P<0.05)高于其他7個(gè)類群，均值分別為19.83、20.90、21.11、20.81、20.01 g；C9、C11和C12類群的粒長(zhǎng)顯著(P<0.05)高于其他9個(gè)類群，均值分別為5.36、5.42、5.39 mm；C8類群的粒寬顯著(P<0.05)高于其他11個(gè)類群，均值為3.45 mm；C4、C9、C11和C12類群的長(zhǎng)寬比顯著(P<0.05)高于其他8個(gè)類群，均值為1.72、1.75、1.75和1.75；C7和C9類群的清蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他10個(gè)類群，均值分別為45.70 mg·g-1和42.59 mg·g-1；C3、C8、C10和C11類群的球蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他8個(gè)類群，均值分別為11.71、11.81、11.58、12.08 mg·g-1；C2、C3、C5、C6、C8和C11類群的醇溶蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他6個(gè)類群，均值分別為5.86、5.31、5.76、5.46、5.42、5.74 mg·g-1；C6和C10類群的谷蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他10個(gè)類群，均值分別為35.11 mg·g-1和37.10 mg·g-1；C6、C9和C10類群的總蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他9個(gè)類群，均值分別為88.87、89.31、85.74 mg·g-1。

白色箭頭代表小米蕎；黑色箭頭代表晉蕎麥2號(hào)。White arrows indicated the value of Xiaomiqiao; Dark arrows indicated the value of Jinqiaomai 2.圖1 苦蕎XJ-RILs群體粒重、粒形與蛋白組分含量頻率分布Fig.1 Frequency distribution of grain weight， grain shape and protein content and component in the XJ-RILs population of tartary buckwheat

表2 苦蕎XJ-RILs群體蛋白組分含量差異

表3 苦蕎XJ-RILs群體粒重、粒形與蛋白組分含量簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)

C9類群的28個(gè)株系的長(zhǎng)寬比和總蛋白含量最高，均值分別為1.75和89.31 mg·g-1，粒長(zhǎng)和清蛋白含量均較高，均值分別為5.36 mm和42.59 mg·g-1；C10類群的13個(gè)株系千粒重和谷蛋白含量最高，均值分別為21.11 g和37.10 mg·g-1，球蛋白和總蛋白含量較高，均值分別為11.58 mg·g-1和85.74 mg·g-1；C11類群的10個(gè)株系粒長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比和球蛋白含量最高，均值分別為5.42 mm、1.75和12.08 mg·g-1，千粒重和醇溶蛋白含量均較高，均值分別為20.81 g和5.74 mg·g-1。

3 結(jié)論與討論

遺傳參數(shù)中的變異系數(shù)可在一定程度上反映性狀的多樣性，變異系數(shù)越大，多樣性程度越高。一般情況下，變異系數(shù)大于10%，說(shuō)明該性狀遺傳多樣性豐富[37]。本文苦蕎XJ-RILs群體千粒重的變異系數(shù)最大(17.13%)，接近該群體F5家系[38]和F6家系[39]的千粒重變異系數(shù)(分別為15.18%和15.90%)，高于翅米蕎×野苦蕎RILs群體百粒重變異系數(shù)(9.06%)[40]和苦蕎種質(zhì)資源百粒重變異系數(shù)(13.67%)[41]，說(shuō)明該群體千粒重變異較為豐富；長(zhǎng)寬比變異系數(shù)次之，為10.62%，這與苦蕎種質(zhì)資源長(zhǎng)寬比變異系數(shù)(11.42%)[41]相近，低于翅米蕎×野苦蕎RILs群體長(zhǎng)寬比的變異系數(shù)15.24%[40]。苦蕎XJ-RILs群體蛋白組分中，谷蛋白含量的變異系數(shù)最大，其次分別為清蛋白、醇溶蛋白和球蛋白，總蛋白變異系數(shù)最小，各蛋白組分均具有豐富的遺傳多樣性，有利于苦蕎不同蛋白組分含量株系的選育。除粒長(zhǎng)和長(zhǎng)寬比外，千粒重、粒寬和各蛋白組分含量均呈近似的正態(tài)分布，說(shuō)明千粒重、粒寬和蛋白組分含量為多基因控制的數(shù)量性狀，而粒長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比呈雙峰分布，說(shuō)明可能存在控制該性狀的主效基因。

圖2 苦蕎XJ-RILs群體粒重、粒形與蛋白含量及其組分的聚類圖Fig.2 Dendrogram of XJ-RILs population in tartary buckwheat based grain weight， grain shape and protein content and components

表4 苦蕎XJ-RILs群體12個(gè)類群間粒重、粒形與蛋白組分含量的差異分析

續(xù)表4 Continued Table 4

苦蕎XJ-RILs群體蛋白組分含量的特點(diǎn)為較高含量的清蛋白和谷蛋白，較低含量的球蛋白和醇溶蛋白。220個(gè)株系中，有160個(gè)株系(72.73%)的蛋白組分含量為清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白，這與劉擁海等[3]研究的5個(gè)苦蕎品種結(jié)果一致。有2個(gè)株系的蛋白組分含量為谷蛋白>清蛋白>醇溶蛋白>球蛋白，這與汪燕等[10]研究的20個(gè)苦蕎品種結(jié)果一致。有1個(gè)株系的蛋白組分含量為清蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白>球蛋白，這與郭曉娜等[11]研究的苦蕎結(jié)果一致，表明該群體蛋白組分含量存在豐富的基因型差異，有利于優(yōu)異株系的篩選。

苦蕎XJ-RILs群體粒重與粒形性狀的相關(guān)性分析表明，千粒重與粒長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)(r=0.567)，這與李春花等[42]對(duì)苦蕎的研究結(jié)果一致，也與水稻[43-45]和大麥[46]中的研究結(jié)果一致；千粒重與粒寬呈極顯著正相關(guān)(r=0.709)，表明粒寬對(duì)千粒重的影響更顯著。千粒重與球蛋白、谷蛋白、總蛋白呈極顯著正相關(guān)，與清蛋白呈顯著正相關(guān)，與醇溶蛋白呈極顯著負(fù)相關(guān)；粒長(zhǎng)與谷蛋白呈極顯著正相關(guān)，與總蛋白呈顯著正相關(guān)，與醇溶蛋白呈極顯著負(fù)相關(guān)；粒寬與球蛋白、總蛋白呈極顯著正相關(guān)；長(zhǎng)寬比與醇溶蛋白呈極顯著負(fù)相關(guān)，與谷蛋白呈顯著正相關(guān)。

基于苦蕎XJ-RILs群體調(diào)查性狀的表型值，將220個(gè)株系聚為12個(gè)類群，為了篩選得到粒形和蛋白組分極端株系和綜合性狀良好的株系，對(duì)類群間各性狀進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，C7類群的12個(gè)株系和C9類群的28個(gè)株系是清蛋白極高端類群；C11類群的10個(gè)株系是球蛋白含量極高端類群。籽粒清蛋白和球蛋白含量極高端類群可為高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)蕎麥?zhǔn)称返募庸ず涂蛊?、降血脂、抗氧化保健品的加工提供重要材料。C2類群的12個(gè)株系、C5類群的10個(gè)株系和C11類群的10個(gè)株系是醇溶蛋白極高端類群；C12類群的28個(gè)株系是醇溶蛋白含量極低端類群。C6類群的17個(gè)株系和C10類群的13個(gè)株系是谷蛋白含量極高端類群；C5類群的10個(gè)株系是谷蛋白含量極低端類群。籽粒醇溶蛋白和谷蛋白極高端類群適合加工為蕎麥面條、饅頭和面包等，極低端類群可以作為腹腔疾病患者的安全食物。C6類群的17個(gè)株系和C9類群的28個(gè)株系是總蛋白含量極高端類群。C9類群的28個(gè)株系粒長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比、清蛋白和總蛋白含量均較高；C10類群的13個(gè)株系千粒重、球蛋白、谷蛋白和總蛋白含量較高；C11類群的10個(gè)株系千粒重、粒長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比、球蛋白和醇溶蛋白含量均較高，可作為千粒重、粒長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和總蛋白含量綜合性狀優(yōu)良株系，可為不同食品、保健品的加工需求提供材料。