祁敏芳 吳慧娟 童軍衛(wèi) 蔣永潑 錢玲珠 楊衛(wèi)星 徐挺立

血管性癡呆是腦內(nèi)長(zhǎng)期缺氧和低灌注引起的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征[1]。腦血管疾病（如缺血性卒中、出血性卒中、腦缺血缺氧）是血管性癡呆的主要臨床病因[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活等許多方面至關(guān)重要，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致多種生長(zhǎng)因子和調(diào)節(jié)因子含量發(fā)生改變[3]。丹參素是丹參水溶性成分中的主要藥效成分之一，具有改善循環(huán)、增強(qiáng)免疫及抗氧化等作用[4]。丹參素對(duì)血管性癡呆認(rèn)知功能障礙的治療效果目前還不清楚。本研究通過(guò)制備血管性癡呆小鼠模型，探討丹參素對(duì)其作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SPF 級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20～25g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2019-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（渝）2019-0029，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：002008134。均飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)（室溫：20～25℃，相對(duì)濕度：50%～70%），動(dòng)物自由取食、飲水，自動(dòng)控制光照/黑暗交替（12h/12h）。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審查，符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)要求。

1.2 藥物 尼莫地平注射液（濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：50mL:10mg，批號(hào)20191013）；丹參素（原料藥，純度：99.99%，南京建成生物工程研究所，批號(hào)HT0611）。丹參素溶于生理鹽水配制成濃度為1、2、3mg/mL 的溶液。

1.3 主要試劑與儀器 星形膠質(zhì)源性蛋白（S-100β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)057458、094355）；RIPA 裂解緩沖液（西安赫特生物科技有限公司，批號(hào)WB118）；硝化纖維素膜（上海玉博生物科技有限公司，批號(hào)P88025）；兔源PI3K、Akt 一抗（武漢博歐特生物科技有限公司，批號(hào)orb137259、orb197041）；3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、羊抗鼠二抗（艾美捷科技有限公司，批號(hào)MG04-05、MG01-02）；Thermo ScientificTMMultiskanTMGO 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermofisher 公司）；BX53 型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；LAS4000 型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)GE Healthcare公司）。

1.4 動(dòng)物建模、分組及給藥 將60 只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（尼莫地平注射液，2mg/kg）[5]、丹參素低（10mg/kg）、中（20mg/kg）、高（30mg/kg）劑量組[6]，每組10 只。其中正常對(duì)照組不做任何處理，其余各組小鼠在禁食、禁水12h 后，3%水合氯醛麻醉，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20min后再灌注10min，重復(fù)2 次，構(gòu)建血管性癡呆小鼠模型[7]。建模成功后，從第1 天開(kāi)始丹參素各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射相應(yīng)的藥物，注射體積均為10mL/kg，正常對(duì)照組和模型組腹腔注射等體積（10mL/kg）生理鹽水，每天1 次，持續(xù)28 天。

1.5 水迷宮實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建Morris 水迷宮，泳池上方放置一個(gè)和電腦相連接的攝像頭，進(jìn)行觀察。給藥28天后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行5 天的水迷宮訓(xùn)練，然后進(jìn)行定位航行測(cè)試：將一個(gè)平臺(tái)放在水池的中央，將小鼠放入水池中，觀察其能否在60s 內(nèi)到達(dá)平臺(tái)上，到達(dá)后停留30s，若未能到達(dá)，則將其強(qiáng)行放在平臺(tái)30s，記錄小鼠逃避潛伏期平均值（逃避潛伏期：從將小鼠放到水池中到爬上平臺(tái)的時(shí)間）[8]。

1.6 腦損傷相關(guān)因子檢測(cè) 給藥結(jié)束后，小鼠眼球取血，2000rpm 離心15min，取上清于1.5mL EP 管中，用ELISA 試劑盒檢測(cè)與腦損傷相關(guān)標(biāo)志物S-100β、NSE 含量。

1.7 小鼠腦組織病理觀察 脫頸處死小鼠，取腦組織，縱向分成兩份，其中一份在4%甲醛溶液中固定48h，進(jìn)行石蠟包埋、切片，厚度5μm，制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片，鏡下觀察各組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)。

1.8 小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白水平檢測(cè) 新鮮分離的小鼠腦組織用PBS 緩沖液洗凈，采用RIPA 裂解緩沖液裂解蛋白，離心提取蛋白溶液。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，將膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2h，然后用PI3K、Akt、GAPDH 一抗在4℃條件下孵育過(guò)夜，1%吐溫20溶液清洗3 次，每次10min，加入羊抗鼠二抗孵育2h，然后在凝膠成像系統(tǒng)上顯影。GAPDH 為內(nèi)參蛋白。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠水迷宮逃避潛伏期比較 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著增加[（46.36±3.12）s 比（15.25±1.23）s，P＜0.05]；與模型組比較，丹參素低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠逃避潛伏期顯著降低[（40.78±3.54）s、（34.65±3.13）s、（26.31±2.01）s、（25.23±1.75）s 比（46.36±3.12）s，P均＜0.05]，隨著丹參素給藥劑量的增加，小鼠逃避潛伏期呈明顯下降趨勢(shì)，具有量-效關(guān)系（P＜0.05）；丹參素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組小鼠血清腦損傷相關(guān)因子S-100β、NSE 水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清腦損傷相關(guān)因子S-100β、NSE 水平顯著升高（P均＜0.05）；與模型組比較，丹參素低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清S-100β、NSE 水平顯著降低（P均＜0.05），隨著丹參素給藥劑量的增加，小鼠血清S-100β、NSE 水平逐漸降低，具有量-效關(guān)系（P＜0.05）；丹參素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清腦損傷相關(guān)因子S-100β、NSE 水平比較（ng/L，）

表1 各組小鼠血清腦損傷相關(guān)因子S-100β、NSE 水平比較（ng/L，）

注：正常對(duì)照組腹腔注射10mL/kg 生理鹽水；模型組腹腔注射10mL/kg生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射2mg/kg 尼莫地平注射液；丹參素低劑量組腹腔注射10mg/kg 丹參素；丹參素中劑量組腹腔注射20mg/kg丹參素；丹參素高劑量組腹腔注射30mg/kg 丹參素；S-100β 為星形膠質(zhì)源性蛋白；NSE 為神經(jīng)元特異性烯醇化酶；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與丹參素低劑量組比較，cP＜0.05；與丹參素中劑量組比較，dP＜0.05

圖1 各組小鼠腦組織病理觀察（HE×100）

2.3 各組小鼠腦組織病理觀察 HE 染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯空泡結(jié)構(gòu)；模型組可見(jiàn)明顯的腦白質(zhì)受損，細(xì)胞排列紊亂，視野中大量空泡結(jié)構(gòu)；在給予丹參素干預(yù)后，隨著丹參素給藥劑量的增加，可見(jiàn)腦組織細(xì)胞排列逐漸變整齊，空泡結(jié)構(gòu)逐漸減少；其中丹參素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組HE 染色結(jié)果基本一致。見(jiàn)圖1。

2.4 各組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平比較與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低（P均＜0.05）；與模型組比較，丹參素低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），隨著丹參素給藥劑量的增加，小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，具有量-效關(guān)系（P均＜0.05）；丹參素高劑量組小鼠腦組織中PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2 和圖2。

3 討論

血管性癡呆為老年人的常見(jiàn)病，是一種與年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙。我們認(rèn)為影響認(rèn)知能力的關(guān)鍵因素是腦白質(zhì)損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、長(zhǎng)期缺氧和低灌注引起的氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡，這也是發(fā)生血管性癡呆的主要原因[9]。

PI3K/Akt 信號(hào)通路是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]。由于外界刺激激活PI3K，磷脂酰肌醇磷酸化產(chǎn)生第二信使：肌醇，在肌醇的控制下，Akt 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，并被Akt 蛋白蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平顯著降低；與模型組比較，隨著丹參素給藥劑量的增加，小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，具有量-效關(guān)系。病理結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯空泡結(jié)構(gòu)；模型組可見(jiàn)明顯的腦白質(zhì)受損，細(xì)胞排列紊亂，視野中大量空泡結(jié)構(gòu)。在給予丹參素干預(yù)后，隨著丹參素給藥劑量的增加，可見(jiàn)腦組織細(xì)胞排列逐漸變整齊，空泡結(jié)構(gòu)逐漸減少。因此，結(jié)合蛋白免疫印跡與病理結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平與血管性癡呆的恢復(fù)程度呈正相關(guān)關(guān)系，其表達(dá)量直接影響血管性癡呆的恢復(fù)情況。提示丹參素可能促進(jìn)小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白的表達(dá)，從而緩解疾病的發(fā)生發(fā)展。

表2 各組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平比較（）

表2 各組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：正常對(duì)照組腹腔注射10mL/kg 生理鹽水；模型組腹腔注射10mL/kg生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射2mg/kg 尼莫地平注射液；丹參素低劑量組腹腔注射10mg/kg 丹參素；丹參素中劑量組腹腔注射20mg/kg丹參素；丹參素高劑量組腹腔注射30mg/kg 丹參素；PI3K 為磷脂酰肌醇-3-激酶；Akt 為蛋白激酶B；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與丹參素低劑量組比較，cP＜0.05；與丹參素中劑量組比較，dP＜0.05

圖2 各組小鼠腦組織中PI3K、Akt 蛋白水平條帶圖

逃避潛伏期可有效反映小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。有研究顯示，血管性癡呆小鼠逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于假手術(shù)組小鼠，經(jīng)谷胱甘肽治療后小鼠逃避潛伏期顯著縮短[13]。S-100β、NSE 為兩種重要的反應(yīng)腦損傷程度的細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠血清S-100β、NSE 兩種細(xì)胞因子較血管性癡呆組顯著降低，其表達(dá)量與腦組織病理?yè)p傷程度呈負(fù)相關(guān)；在給予相應(yīng)的治療后，S-100β、NSE 含量降低[14]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，血清S-100β、NSE 水平顯著升高；在給予丹參素干預(yù)后，小鼠逃避潛伏期縮短，血清S-100β、NSE水平顯著降低，且隨著丹參素劑量的增加，逃避潛伏期、血清S-100β、NSE 水平變化具有量-效關(guān)系。說(shuō)明丹參素能顯著改善血管性癡呆小鼠的腦損傷。

綜上所述，丹參素可能通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)PI3K、Akt 蛋白及腦損傷相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，以改善血管性癡呆小鼠的腦損傷。