邵 琰 牟微娜 俞瑩瑩

雖然膿毒癥的診斷和治療已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但總的死亡率仍然保持在30%～40%左右[1]。在膿毒癥的發(fā)展過程中，肝臟在清除細(xì)菌和產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的防御反應(yīng)中起著重要作用。然而，肝臟也是炎癥反應(yīng)失調(diào)的靶點(diǎn)，肝功能障礙預(yù)示著更糟糕的結(jié)果[2]。以往研究表明，環(huán)氧化酶-2（COX-2）/NF-E2 相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路是免疫防御膿毒癥的重要途徑，并負(fù)責(zé)細(xì)胞完整性、功能和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，可以降低感染性損傷的發(fā)病率和死亡率[3]。山茱萸是傳統(tǒng)中藥，有補(bǔ)益肝腎，收斂固澀功效。最新研究表明，山茱萸具有增強(qiáng)免疫和抗氧化活性的作用[4]。本研究探討山茱萸提取物對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠肝損傷的干預(yù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠購自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8～10 周齡，體質(zhì)量200～230g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2019-0005，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2019-0033，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SDYC-201913697，在相對(duì)濕度55%，溫度25℃，自然光照，自由進(jìn)食、進(jìn)水的環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)過浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核備案，批件號(hào)：（倫審）202001004 號(hào)。

1.2 主要試劑 山茱萸提取物（原料藥，純度99%，西安品健生物科技有限公司，批號(hào)77-52-3），將山茱萸提取物和生理鹽水配制成濃度分別為：0.4、0.8、1.2g/mL 的溶液；烏司他丁注射液（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：1mL:5 萬U，批號(hào)20191209）；蘇木精-伊紅（HE）染色液、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)分別為C0107、SF-1437）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和膽紅素（BIL）檢測試劑盒（中生北控生物科技有限公司，批號(hào)分別為E-53820、A127889、JKSJ--1564）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)分別為MM-0670R22、MM-0670R95）；谷胱甘肽（GSH）、髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為A005、E004-4-12）；蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)AR0103）；COX-2、Nrf2 和血紅素氧化酶-1（HO-1）抗體（美國Santa Cruz 公司，批號(hào)分別為sc-52159、sc-39345、sc-58684）；β-actin 抗體、辣根過氧化物酶HRP 標(biāo)記親和純化山羊抗大鼠IgG 二抗（武漢艾美捷科技有限公司，批號(hào)分別為C1313、115-035-003）。

1.3 主要儀器 ASP300S 型組織脫水機(jī)、EG1150 型包埋機(jī)、Leica RM2255 型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備（德國Leica 公司）；LV100ND 型顯微鏡（日本尼康公司）；AU2700 型全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus 公司）；HBS-1096B 型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DYCZ-25D 型垂直電泳儀（上海熙浩實(shí)業(yè)有限公司）；JS-780 型凝膠成像儀（杭州得聚儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 分組、造模及給藥 選60 只成年雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法均分為假手術(shù)組、模型組、山茱萸低、中、高劑量組和烏司他丁組，每組10 只。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥大鼠模型[5]，操作如下：對(duì)所有大鼠進(jìn)行麻醉，作1cm 長的正中切口，暴露盲腸。模型組、山茱萸低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠將盲腸用3-0 絲結(jié)扎，21 號(hào)針穿刺2 次，輕輕擠壓出少量糞便，重新定位盲腸，然后用3-0 絲線將腹部逐層縫合關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠也進(jìn)行同樣的手術(shù)，但不結(jié)扎和穿刺。手術(shù)后，將大鼠放回籠子里，自由獲得水和食物。造模1h后，山茱萸低、中、高劑量組大鼠分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物[6]，灌胃體積10mL/kg，同時(shí)尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組大鼠灌胃10mL/kg生理鹽水同時(shí)尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg[7]，注射體積2mL；假手術(shù)組和模型組大鼠分別灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水，24h 后麻醉，心臟取血，處死大鼠進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.5 大鼠肝組織病理學(xué)觀察 取部分大鼠肝組織，用10%甲醛進(jìn)行固定24h，經(jīng)脫水、包埋、切片（3μm），進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化。

1.6 全自動(dòng)生化分析儀檢測肝功能指標(biāo) 將3mL血液以3000r/min 離心15min 分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清ALT、AST 和BIL 水平。

1.7 ELISA 法檢測肝組織GSH、MPO、IL-6 和TNFα 表達(dá)水平 取大鼠肝組織，加入生理鹽水（1:10）制成勻漿，5000r/min 離心10min，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測肝組織GSH、MPO、IL-6 和TNF-α水平。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平 取約100mg 大鼠肝組織研碎，根據(jù)組織重量加入相應(yīng)蛋白抽提試劑，冰浴2h，離心后取上清，進(jìn)行電泳，每孔上樣量為30μg，將印跡轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1h，加入COX-2（1:500）、Nrf2（1:500）和HO-1（1:800）和β-actin（1:1000）抗體，4℃孵育過夜，將二抗（1:5000）在室溫下孵育30min。用ECL 法進(jìn)行顯色，采集圖像，用AlphaEaseFC 圖像分析進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)比較 假手術(shù)組大鼠肝組織未見病理損害；模型組大鼠肝組織見大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞水腫和壞死，肝索及肝竇消失；各山茱萸劑量組和烏司他丁組大鼠肝組織可見不同程度淤血、肝竇輕度擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤，但其損傷程度明顯輕于模型組，且山茱萸高劑量組和烏司他丁組無明顯差異。見圖1。

2.2 各組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平增加（P均＜0.05）；與模型組比較，各山茱萸劑量組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平降低，呈劑量依賴性（P均＜0.05）；烏司他丁組和山茱萸高劑量組血清ALT、AST 和BIL 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肝組織GSH 和MPO 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織GSH 水平降低、MPO 水平增加（P均＜0.05）；與模型組比較，各山茱萸劑量組大鼠肝組織GSH 水平增加、MPO 水平降低，呈劑量依賴性（P均＜0.05）；山茱萸高劑量組GSH和MPO 水平與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α水平增加（P均＜0.05）；與模型組比較，各山茱萸劑量組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α 水平降低，呈劑量依賴性（P均＜0.05）；山茱萸高劑量組IL-6 和TNF-α水平與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表1 各組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比較（）

表1 各組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比較（）

注：假手術(shù)組、模型組灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水；山茱萸低、中、高劑量組分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃體積10mL/kg），同時(shí)尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg（注射體積2mL），同時(shí)灌胃10mL/kg 生理鹽水；ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST 為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；BIL 為膽紅素；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與山茱萸低劑量組比較，cP＜0.05；與山茱萸中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組大鼠肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織COX-2 蛋白表達(dá)水平增加、Nrf2 和HO-1 蛋白水平降低（P均＜0.05）；與模型組比較，各山茱萸劑量組大鼠肝組織COX-2 蛋白水平降低、Nrf2 和HO-1蛋白水平增加，呈劑量依賴性（P均＜0.05）；山茱萸高劑量組COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4和圖2。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)比較（HE×200）

表2 各組大鼠肝組織GSH 和MPO 水平比較（）

表2 各組大鼠肝組織GSH 和MPO 水平比較（）

注：假手術(shù)組、模型組灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水；山茱萸低、中、高劑量組分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃體積10mL/kg），同時(shí)尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg（注射體積2mL），同時(shí)灌胃10mL/kg 生理鹽水；GSH 為谷胱甘肽；MPO 為髓過氧化物酶；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與山茱萸低劑量組比較，cP＜0.05；與山茱萸中劑量組比較，dP＜0.05

表3 各組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α 水平比較（pg/mL，）

表3 各組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α 水平比較（pg/mL，）

注：假手術(shù)組、模型組灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水；山茱萸低、中、高劑量組分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃體積10mL/kg），同時(shí)尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg（注射體積2mL），同時(shí)灌胃10mL/kg 生理鹽水；IL-6 為白細(xì)胞介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與山茱萸低劑量組比較，cP＜0.05；與山茱萸中劑量組比較，dP＜0.05

3 討論

膿毒癥是肝損傷的早期事件。因此，治療膿毒癥可能為肝損傷的治療提供重要的輔助作用。烏司他丁是常用抗炎藥，但其具有一定的副作用[8]。山茱萸具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎和抗氧化等作用，常用于保肝方面的治療[9]。

膿毒癥期間，促炎性細(xì)胞因子的過度釋放導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷和肝損傷。這些細(xì)胞因子，特別是TNF-α 和IL-6，在膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷中起重要作用，且TNF-α 和IL-6 水平持續(xù)升高與預(yù)后較差有關(guān)[10]。血清AST 水平升高的同時(shí)引起肝氧化應(yīng)激參數(shù)的變化。同樣，GSH 在防止細(xì)胞氧化損傷中也起著重要作用，GSH 水平降低表明氧化應(yīng)激反應(yīng)的紊亂。MPO 是嗜中性粒細(xì)胞中的一種蛋白質(zhì)，參與膿毒癥患者的早期炎癥過程，其在化膿性疾病中的升高，導(dǎo)致肝功能障礙[11]。本研究結(jié)果顯示，山茱萸提取物能降低膿毒癥大鼠血清AST、ALT 和BIL 水平，進(jìn)而降低氧化應(yīng)激水平（GSH 水平降增加，MPO 水平降低），抑制炎癥因子的釋放（TNF-α 和IL-6 水平降低），發(fā)揮肝功能保護(hù)作用。病理結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織見大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞水腫和壞死，肝索及肝竇消失；各山茱萸劑量組可見不同程度淤血、肝竇輕度擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤，但其損傷程度明顯輕于模型組，也支持了上述推斷。

表4 各組大鼠肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白水平比較（）

表4 各組大鼠肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白水平比較（）

注：假手術(shù)組、模型組灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水；山茱萸低、中、高劑量組分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃體積10mL/kg），同時(shí)尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg（注射體積2mL），同時(shí)灌胃10mL/kg 生理鹽水；COX-2 為環(huán)氧化酶-2；Nrf2 為NF-E2 相關(guān)因子2；HO-1 為血紅素氧化酶-1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與山茱萸低劑量組比較，cP＜0.05；與山茱萸中劑量組比較，dP＜0.05

圖2 各組大鼠肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)

目前已知，膿毒癥的病理機(jī)制中涉及到COX-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）這兩種酶[12]。COX-2是一種誘導(dǎo)酶，催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為炎癥性前列腺素，在膿毒癥中加重炎癥反應(yīng)和損傷器官。已經(jīng)證明，膿毒癥的損傷通過COX-2 的誘導(dǎo)激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2）。此外，COX-2 的抑制或缺失可減少內(nèi)毒素誘導(dǎo)的PGE2，提高膿毒癥大鼠的存活率[13]。研究表明，COX-2 在急性肺損傷（ALI）的發(fā)展中起重要作用，COX-2 水平隨著ALI 嚴(yán)重程度的增加而增加，而COX-2 的抑制減弱ALI 在酸誘導(dǎo)ALI 小鼠模型中的作用[14]。Nrf2 是膿毒癥中各種促炎細(xì)胞因子表達(dá)的重要下游調(diào)節(jié)因子，通常以滅活的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)被炎癥刺激激活時(shí)，它易位至細(xì)胞核并啟動(dòng)許多炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，例如TNF-α，IL-6，COX-2 和iNOS[15]。在膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷患者的各種炎性細(xì)胞中已檢測到Nrf2 活化被抑制[16]。同時(shí)，HO-1 是Nrf2 激活調(diào)控的主要抗炎酶，內(nèi)源性HO-1 在多種應(yīng)激刺激下廣泛表達(dá)并高度誘導(dǎo)，在宿主防御過度炎癥損傷中發(fā)揮重要作用。通過藥物或基因轉(zhuǎn)移上調(diào)HO-1，可在炎癥和免疫反應(yīng)等多種情況下發(fā)揮治療作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸提取物能降低肝組織COX-2 蛋白水平，同時(shí)增加Nrf2和HO-1 蛋白水平，從而發(fā)揮膿毒癥大鼠肝損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，山茱萸提取物可能通過影響COX-2/Nrf2 信號(hào)通路，降低膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠肝組織炎癥細(xì)胞因子水平，對(duì)抗氧化應(yīng)激，保護(hù)膿毒癥引起的肝損傷。