楊慶芳 彭 彥 郭 飛 張澤立 楊慶霞

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌）是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有浸潤(rùn)性強(qiáng)，易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，并且預(yù)后差，死亡率高。其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，受環(huán)境及自身因素的影響。目前還缺少有效的治療方法，并且發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。在肝癌的各項(xiàng)致癌因素中，肝硬化是導(dǎo)致肝癌的主要病因。在臨床上，幾乎所有被診斷為肝癌的患者都有肝硬化的病史[1]。針對(duì)肝硬化患者的篩查項(xiàng)目有助于診斷出早期肝癌[2]。盡管已經(jīng)有很多研究被開(kāi)展，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的早期診斷，并揭示肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。比如Zheng團(tuán)隊(duì)[3]研究發(fā)現(xiàn)，SFN 蛋白在癌前病變組織和肝癌組織的蛋白表達(dá)譜有顯著差異，并且在肝癌組織高表達(dá)，該結(jié)果提示SFN 蛋白可能在肝癌的發(fā)生中起到作用，可作為肝癌早期診斷的生物標(biāo)志物。然而，由于缺少對(duì)肝硬化到肝癌這一惡化階段基因組層面的分析，目前尚無(wú)在肝硬化人群中診斷出早期肝癌的有效方法[4]?；诖?，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的肝癌數(shù)據(jù)，應(yīng)用差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體學(xué)和信號(hào)通路的富集分析，初步探討肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所參與的生物過(guò)程及信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究所選取的樣本為GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的GSE17548數(shù)據(jù)集，共包括17 個(gè)肝癌樣本，20 個(gè)肝硬化樣本數(shù)據(jù)。肝癌和肝硬化組織RNA 樣品的微陣列分析是基于Gene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 陣列的Affymetrix 平臺(tái)。將CEL 文件下載后，是基于R 語(yǔ)言（http://www.r-project.org）平臺(tái)進(jìn)行分析，包括原始數(shù)據(jù)的讀取和數(shù)據(jù)的歸一化等預(yù)處理。

1.2 差異表達(dá)基因識(shí)別 對(duì)于GEO 下載的標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)，我們用DESeq2 軟件包（DESeq2 package 1.16.1）進(jìn)行差異表達(dá)的分析。DESeq2 包中提供的統(tǒng)計(jì)程序，是基于負(fù)二項(xiàng)式分布的模型來(lái)確定基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)。使用Benjamini 和Hochberg的方法來(lái)調(diào)整所得的P 值以控制錯(cuò)誤出現(xiàn)率，最終將調(diào)整后的P＜0.05 以及l(fā)og2FC＞2 作為顯著差異表達(dá)的閾值，挑選的基因作為差異表達(dá)基因。

1.3 差異表達(dá)基因功能分析 使用TopGO 軟件包（TopGO package 2.34.0）對(duì)所篩選出來(lái)的差異基因，進(jìn)行基因本體學(xué)（Gene Oncology，GO）分析。按照P＜0.05 的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出參與肝癌的生物進(jìn)程的GO 條目。對(duì)識(shí)別的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genomes）通路富集分析。應(yīng)用cluster－Profiler R 軟件包分析KEGG 通路，從分子水平的信息中了解生物系統(tǒng)的功能和效用。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因識(shí)別 對(duì)17 個(gè)肝癌樣本和20 個(gè)肝硬化樣本的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)差異表達(dá)基因分析，以揭示肝癌組與肝硬化組的差異。以ttest 顯著檢驗(yàn)所得P 值的對(duì)數(shù)值-lg（p-value）為縱坐標(biāo)，以差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值log2（fold change，F(xiàn)C）為橫坐標(biāo)繪制火山圖（見(jiàn)圖1）。紅點(diǎn)表示肝癌組織組相比于肝硬化組織組上調(diào)mRNA，藍(lán)點(diǎn)表示肝癌組織組相比于肝硬化組織組下調(diào)，灰點(diǎn)表示未顯著差異表達(dá)mRNA。以差異倍數(shù)FC＞2 和P＜0.05 為篩選閾值篩選差異表達(dá)基因，得出差異表達(dá)的基因共486 個(gè)。相對(duì)于肝硬化組織組，肝癌組織組有157 個(gè)基因上調(diào)，329 個(gè)基因下調(diào)（見(jiàn)表1），分別列舉了肝癌組織相對(duì)肝硬化組織高表達(dá)和低表達(dá)的前20 個(gè)基因。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖

表1 肝癌和肝硬化組織差異表達(dá)基因前20

對(duì)表1 中的肝癌和肝硬化組織差異表達(dá)的20個(gè)基因進(jìn)行聚類分析（見(jiàn)圖2），在肝癌中差異表達(dá)的基因明顯分成了兩個(gè)部分，上調(diào)的基因聚在一起，下調(diào)的基因聚在一起。此外，基本上所有的肝癌樣本和肝硬化樣本也被區(qū)分開(kāi)來(lái)。從這個(gè)聚類圖可以看到，所篩選的這20 個(gè)基因，在肝癌樣本和肝硬化具有較好的分類能力。

圖2 差異表達(dá)基因的聚類分析熱圖

2.2 差異表達(dá)基因功能和通路富集分析 為了探究差異表達(dá)基因在肝癌和肝硬化發(fā)病中的生物學(xué)過(guò)程及其功能，將FC＞2 且P＜0.05 的差異基因進(jìn)行GO富集分析（見(jiàn)圖3），列舉了前十個(gè)顯著的GO 條目。差異表達(dá)基因顯著富集到Cell cycle（細(xì)胞周期）、Cell division（細(xì)胞分裂）、Mitosis（有絲分裂）、Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝）等一系列跟癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)GO 功能條目。

本研究利用KEGG 通路富集分析來(lái)找尋差異表達(dá)基因參與調(diào)控的相關(guān)通路（見(jiàn)表2）。研究發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要集中在Retinol metabolism（視黃醇代謝）、Chemical carcinogenesis（化學(xué)致癌作用）、Drug metabolism-cytochrome P450（藥物代謝-細(xì)胞色素P450）、Cell cycle（細(xì)胞周期）、p53 signaling pathway（p53 信號(hào)通路）、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450（細(xì)胞色素P450 對(duì)外源物質(zhì)的代謝）等16 個(gè)信號(hào)通路上。

圖3 差異表達(dá)基因GO 富集分析

3 討論

目前，肝癌發(fā)病機(jī)制及分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。普遍認(rèn)為是一個(gè)多基因參與、多步驟改變的復(fù)雜過(guò)程，目前缺乏有效的早期診斷手段。雖然，近年肝癌的生存率有所提高，但五年生存率仍不到10%。因此，早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)和正確診斷肝癌對(duì)提高其根治率、改善患者預(yù)后具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，促癌基因激活和（或）抑癌基因失活能使基因表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖及凋亡混亂，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。因此對(duì)這些變化的基因進(jìn)行研究，或許能為肝癌的診療提供幫助。從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度來(lái)看，高通量測(cè)序可以通過(guò)分析樣品中的全部RNA，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組變化規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)研究。將其應(yīng)用于肝癌研究，能在分子層面鑒定與肝癌臨床表型有關(guān)的樞紐基因，為進(jìn)一步探索肝癌發(fā)病機(jī)制提供新的思路和理論基礎(chǔ)，對(duì)理解肝癌分子遺傳基礎(chǔ)也具有重要意義。

表2 KEGG 分析差異表達(dá)基因參與的信號(hào)通路

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)方法，對(duì)肝癌組織和肝硬化組織樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。篩選到486 個(gè)差異基因，相對(duì)于肝硬化組織，肝癌組織有157 條基因表達(dá)上調(diào)，比如，基因SPINK1在肝癌組表達(dá)量為肝硬化組的3.02 倍（P＜0.05）。Lee等[7]研究發(fā)現(xiàn)，SPINK1 能在HCC 患者高表達(dá)，其研究認(rèn)為SPINK1 對(duì)肝癌細(xì)胞起著生長(zhǎng)因子的作用，有增加腫瘤轉(zhuǎn)移可能。相對(duì)于肝硬化組織，329 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，比如，基因CXCL14 在肝硬化組表達(dá)量為肝癌組2.46 倍（P＜0.05）。Lin 等[8]發(fā)現(xiàn)，CXCL14 在肝癌組織，以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和宮頸鱗狀細(xì)胞癌是一種明顯低表達(dá)的基因?；騀CN3 在肝硬化組表達(dá)量為肝癌組的2.35 倍（P＜0.05）。研究顯示，F(xiàn)CN3在HCC 中可作為腫瘤的潛在生物標(biāo)志物[9-10]。本研究通過(guò)對(duì)差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)在肝硬化惡化為肝癌的過(guò)程中，“細(xì)胞周期”“有絲分裂”等生物過(guò)程受到影響。這也暗示這些顯著功能節(jié)點(diǎn)中包含的基因很可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，各種細(xì)胞周期蛋白的異常激活導(dǎo)致不受機(jī)體控制的增殖是惡性腫瘤的特性之一[11-12]。王秀麗[13]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中細(xì)胞周期素依賴性激酶CDK1、CDK4 及細(xì)胞周期依賴性激酶抑制物CDKN2C 等持續(xù)高表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂、細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步研究差異表達(dá)基因主要參與的代謝途徑和信號(hào)通路，我們進(jìn)行了KEGG 信號(hào)通路富集分析，并且發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要集中在視黃醇代謝、化學(xué)致癌作用、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、細(xì)胞周期、p53 信號(hào)通路、細(xì)胞色素P450 對(duì)外源物質(zhì)的代謝等16 個(gè)信號(hào)通路上。研究表明，非環(huán)狀類視黃醇是一種合成的視黃醇類代謝物，能夠抑制Ras/MAP 激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而降低視黃酸受體磷酸化水平而阻止肝癌的進(jìn)展[14]。細(xì)胞色素P450 主要存在于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，在許多器官和組織中都有表達(dá)，但在肝臟中含量最為豐富[15]，CYP1A2 是人體肝臟組織中主要的CYP 之一，Wuensch 等[16]發(fā)現(xiàn)，CYP1A2 在肝癌組織低表達(dá)，這與本研究結(jié)果一致。同時(shí)也有最新研究表明，在丙型病毒性肝炎相關(guān)肝癌中CYP1A2 已經(jīng)可以作為判斷患者早期術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[17]。

本研究從整體上揭示差異基因的功能、代謝途徑和信號(hào)通路，為研究肝癌的發(fā)病提供新的證據(jù)和研究思路。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、基因芯片和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高通量數(shù)據(jù)海量增加，與肝癌生長(zhǎng)、蔓延、轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因和蛋白也越來(lái)越受到關(guān)注。目前研究也取得巨大進(jìn)展，這些成果對(duì)肝癌的早期診斷、藥物選擇、預(yù)后判斷提供很大幫助，但由于肝癌相關(guān)的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，有許多研究尚處于實(shí)驗(yàn)階段。因此，對(duì)肝癌分子機(jī)制的研究還有廣泛的前景。