陳偉達(dá) 石 瑋 楊繼國(guó) 陳 騰

骨關(guān)節(jié)炎是骨科臨床常見病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。微小核糖核酸（miRs）是小的非蛋白質(zhì)編碼RNA，其與靶mRNA 的30 個(gè)非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合并且被認(rèn)為是新的基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑。作為血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的缺氧敏感性miR，微小核糖核酸-24（miR-24）與軟骨細(xì)胞分化和增殖有關(guān)[2]。原癌基因（C-myc）可編碼轉(zhuǎn)錄因子，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和凋亡[3]。C-myc 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)促炎介質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子-α，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），一氧化氮（NO）和前列腺素。研究[4]證實(shí)，C-myc可作為誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑，而軟骨細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度相關(guān)性明顯。文獻(xiàn)[5]報(bào)道，miR-24 可抑制C-myc 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，生長(zhǎng)和凋亡。三七總皂苷其主要成份為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1，作用為活血祛瘀，通脈活絡(luò)[6]。具有抑制血小板聚集和增加腦血流量的作用，常用于腦血管后遺癥，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞，眼前房出血等[7]。研究[8]表明，三七總皂苷能夠保護(hù)骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨細(xì)胞免于變性。本研究探討三七總皂苷經(jīng)miR-24 靶向C-myc 對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡與增殖的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD 大鼠購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8 周齡，體質(zhì)量180～220g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2018-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2018-0023，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：2019012706，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物 三七總皂苷（原料藥，純度99%，杭州甫洛生物科技有限公司，批號(hào)CAS-2037-50）。

1.3 試劑 低葡萄糖Dulbecco 改良Eagle's 培養(yǎng)基（L-DMEM）溶液（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)M0063）；Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)SA66143）；鏈霉素和青霉素（武漢Procell 生命科技有限公司，批號(hào)AW65987、AW145624）；胎牛血清（FBS）、放射免疫沉淀測(cè)定裂解緩沖液、CCK-8 試劑（碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)BF24593、BF20119、BF11665）；FITC 膜聯(lián)蛋白V 凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD Pharmingen 公司，批號(hào)MB58741）；TRIzol 試劑、RevertAid 第一鏈cDNA 合成試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)14865、14654）；SYBR Premix Ex Taq 熒光定量PCR 試劑盒、二乙基焦碳酸酯處理水（日本Takara 公司，批號(hào)T0037、T2548）；C-myc 單克隆抗體、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)P60253、HC1012）；辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗大鼠二抗、HRP 底物顯色試劑盒（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)SA00001-1、WBKLS0100）。

1.4 儀器 HF90 型CO2培養(yǎng)箱（力新儀器上海有限公司）；IX83 型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Bio-Tek Synergy 2 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；NanoDrop 2000C 型分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；ChemiDoc XRS 型凝膠成像系統(tǒng)、CFX 96TM 型實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備 SD 大鼠麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，兩側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)備皮，曲屈大鼠膝關(guān)節(jié)，于關(guān)節(jié)兩側(cè)進(jìn)針，在1、4、7 天分別將0.2mL 4%木瓜蛋白酶水溶液注射到膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)（刺破關(guān)節(jié)腔時(shí)有突破感，注射藥物時(shí)無(wú)阻力）。隨后進(jìn)行膝關(guān)節(jié)Lequesne MG 評(píng)估級(jí)別，平均評(píng)分＞40 說(shuō)明大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型建立成功[9]。

2.2 骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞獲取及培養(yǎng) 脫臼處死骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠，無(wú)菌收集兩側(cè)膝關(guān)節(jié)的全部軟骨組織，使用眼科剪刀將其均勻地切成1mm×1mm×1mm的片段。用L-DMEM 溶液洗滌所獲骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞。然后，將骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有1.5g/L Ⅱ型膠原酶的新培養(yǎng)皿中，然后將其置于培養(yǎng)箱中在37℃下孵育4h，接著將細(xì)胞懸浮液消化，用不銹鋼過(guò)濾器（150 目）過(guò)濾，以3000rpm 的速度離心10min，去上清液。加入150U/mL 鏈霉素和150U/mL青霉素以及13% FBS 孵育24h，更換營(yíng)養(yǎng)液，之后每3 天更換1 次營(yíng)養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)直至細(xì)胞匯合達(dá)到85%后，收集細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 分組設(shè)計(jì) 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組：取10mL 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組液（細(xì)胞濃度為5×106/mL）于10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、20%O2）；三七總皂苷低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)方法同骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組，分別加入三七總皂苷（最終濃度分別為：100、200、400μg/mL）[10]。各組細(xì)胞分別設(shè)6 個(gè)平行樣本，培養(yǎng)72h。

2.4 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活力檢測(cè) CCK-8 測(cè)定骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活力。各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，每組加入10μL CCK-8 染色劑，按照制造商的說(shuō)明書操作。用于比色分析的裝置是Bio-Tek Synergy 2 型酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)為450nm，讀取吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD 值/空白組OD值）×100%?？瞻捉M為蒸餾水調(diào)零組。

2.5 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞菌落數(shù)水平測(cè)定 選擇處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并通過(guò)移液將其懸浮于單個(gè)細(xì)胞中，然后接種到10cm 培養(yǎng)皿中。用梯度因子進(jìn)一步稀釋細(xì)胞懸浮液，將約500 個(gè)細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中，在37℃下培養(yǎng)2～3 周直至出現(xiàn)可見的菌落，用PBS 輕輕洗滌培養(yǎng)皿兩次，將細(xì)菌用5mL 甲醇固定15min，用吉姆薩染色10～30min，然后計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)含有至少50 個(gè)細(xì)胞的活菌落。

2.6 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡水平測(cè)定 FITC 膜聯(lián)蛋白V 凋亡檢測(cè)試劑盒用于測(cè)定細(xì)胞凋亡率。將培養(yǎng)結(jié)束的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞（每孔5×105個(gè)細(xì)胞）接種到6 孔板中，重懸于1X 結(jié)合緩沖液，與5μL 異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V 和5μl PI 在黑暗中于25℃下溫育15min。在1h 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

2.7 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞miR-24、C-myc mRNA 水平測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，使用TRIzol 試劑提取總RNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用RevertAid 第一鏈cDNA 合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Premix Ex Taq 熒光定量PCR 試劑盒檢測(cè)mRNA 水平。引物由日本Takara 公司設(shè)計(jì)合成。使用以下引物：miR-24 正向5'-TTCCCCAGCAACTACGTGAC-3'和miR-24 反 向5'-TCTAACAACTGAATGGGCGG-3'；C-myc 正向5'-CACGTCTCAGTGCATCACAGA-3'和C-myc 反 向5'-GTGCAGGGTCCGAGGTCCATG-3'；U6 正向5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' 和U6反向5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。將miR-24、C-myc mRNA 的水平標(biāo)準(zhǔn)化至U6。使用實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)和含有cDNA 模板引物，SYBR Premix Ex Taq 試劑、二乙基焦碳酸酯處理水的PCR 混合物進(jìn)行PCR。使用以下熱循環(huán)條件：94℃持續(xù)10s 隨后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，94℃10s，60℃持續(xù)20s 和72℃持續(xù)10s。使用2-ΔΔCt 方法計(jì)算miR-24、C-myc mRNA 表達(dá)水平。

2.8 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞C-myc 蛋白水平測(cè)定 使用放射免疫沉淀測(cè)定裂解緩沖液從骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，使用分光光度計(jì)定量總蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來(lái)自每種提取物的等量（100μg）蛋白質(zhì)，然后在300mA 下電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上1h。用5%脫脂乳在室溫下封閉1h 后，將印跡與C-myc 一抗（1：1000 稀釋）以及β-actin 單克隆抗體（1：1000 稀釋）在4℃過(guò)夜，與辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗大鼠二抗（1：2000 稀釋）孵育后，使用HRP 底物顯色試劑盒以及凝膠成像系統(tǒng)顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。使用ImageJ 軟件版本進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶的灰度值分析以定量蛋白質(zhì)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q 檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞OD 值、存活率比較與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組OD 值增加、存活率升高（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組OD 值、存活率逐漸升高（P均＜0.05）。見表1。

3.2 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞菌落數(shù)比較 與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細(xì)胞菌落數(shù)增加（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細(xì)胞菌落數(shù)逐漸增加（P均＜0.05）。見表2，圖1。

表1 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞OD 值、存活率比較（）

表1 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞OD 值、存活率比較（）

注：骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞；三七總皂苷低劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+100μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷中劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+200μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷高劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+400μg/mL 三七總皂苷；OD 為吸光度；與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，aP＜0.05；與三七總皂苷低劑量組比較，bP＜0.05；與三七總皂苷中劑量組比較，cP＜0.05

表2 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞菌落數(shù)、凋亡率比較（）

表2 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞菌落數(shù)、凋亡率比較（）

注：骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞；三七總皂苷低劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+100μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷中劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+200μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷高劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+400μg/mL 三七總皂苷；與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，aP＜0.05；與三七總皂苷低劑量組比較，bP＜0.05；與三七總皂苷中劑量組比較，cP＜0.05

3.3 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡率比較 與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組凋亡率降低（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組凋亡率逐漸降低（P均＜0.05）。見表2。

3.4 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞miR-24、C-myc mRNA表達(dá)水平比較 與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細(xì)胞miR-24 mRNA 表達(dá)量增加（P均＜0.05），C-myc mRNA 表達(dá)量降低（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細(xì)胞miR-24 mRNA 表達(dá)量逐漸升高，C-myc mRNA 表達(dá)量逐漸降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞miR-24、C-myc mRNA、C-myc 蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞miR-24、C-myc mRNA、C-myc 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞；三七總皂苷低劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+100μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷中劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+200μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷高劑量組為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞+400μg/mL 三七總皂苷；miR-24 為微小核糖核酸-24；C-myc 為原癌基因；C-myc 為原癌基因；與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，aP＜0.05；與三七總皂苷低劑量組比較，bP＜0.05；與三七總皂苷中劑量組比較，cP＜0.05

3.5 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞C-myc 蛋白表達(dá)水平比較 與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細(xì)胞C-myc 蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細(xì)胞C-myc 蛋白表達(dá)量逐漸降低（P均＜0.05）。見表3。

4 討論

三七總皂苷源于三七的干燥根及根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功能。研究表明，三七總皂苷具有抗炎、抗癌、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡等[11]。三七總皂苷可抑制SNP 刺激的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡并改善大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中的軟骨退化[12]。本研究結(jié)果顯示，與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組OD值、存活率、細(xì)胞菌落數(shù)升高，凋亡率降低；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組OD 值、存活率、細(xì)胞菌落數(shù)逐漸升高，凋亡率逐漸降低。說(shuō)明三七總皂苷具有抗骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡特性，并能促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞增殖，而減輕細(xì)胞凋亡過(guò)程可以緩解軟骨退變的進(jìn)展。

圖1 各組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞菌落數(shù)比較（吉姆薩染色×400）

通過(guò)對(duì)各組軟骨細(xì)胞miR-24 mRNA 分析結(jié)果顯示，與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細(xì)胞miR-24 mRNA 表達(dá)水平增加。結(jié)合前述各組軟骨細(xì)胞凋亡、增殖水平；推測(cè)miR-24 可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，并抑制軟骨細(xì)胞凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-24 可能在促進(jìn)增殖和預(yù)防軟骨細(xì)胞凋亡中起重要作用[13]。miR-24 是一種潛在的基因和藥物治療靶點(diǎn)，能夠抑制腦梗死大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，此外，miR-24 所起的抗細(xì)胞凋亡作用也可能在細(xì)胞增殖中起作用[14]。本研究結(jié)果顯示，隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細(xì)胞miR-24 mRNA 逐漸升高。說(shuō)明三七總皂苷能促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞miR-24 mRNA 高表達(dá)，進(jìn)而起到抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞C-myc mRNA 和蛋白表達(dá)上調(diào)[15]。體外細(xì)胞試驗(yàn)顯示[16]，miR-24 可能下調(diào)C-myc 表達(dá)，從而抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。文獻(xiàn)報(bào)道，C-myc 高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞遷移和乳腺癌細(xì)胞系侵襲的顯著增加；C-myc 能夠參與干細(xì)胞更新、代謝、生長(zhǎng)、增殖、凋亡、血管生成、分化、翻譯和核糖體生物發(fā)生；miR-24 能夠通過(guò)結(jié)合其3'-UTR 來(lái)下調(diào)C-myc[17]。本研究結(jié)果顯示，與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細(xì)胞mRNA 和C-myc 蛋白降低；且隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細(xì)胞C-myc mRNA 和蛋白逐漸降低。說(shuō)明三七總皂苷能靶向上調(diào)miR-24 mRNA 表達(dá)，抑制C-myc mRNA 和蛋白的表達(dá)。

綜上所述，三七總皂苷能抑制骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞增殖；其機(jī)制可能與三七總皂苷能靶向上調(diào)miR-24 mRNA 進(jìn)而抑制C-myc mRNA 和蛋白的表達(dá)有關(guān)。